*Corresponding author: Jeong-hee Kim Tel : +82-63-850-6898 E-mail : I. 서 론
대기 중의 PM 10(particulate matter 10 μm)은 지름이 1000분의 10 mm 보다 작은 먼지로 대기 중의 황산화물(SOX), 질소산화물(NOX), 휘발성유기화합물(VOC), 암모니아(NH3) 등이 특정 조건에 반응하여 2차로 생성되는 물질이다(KOSIS, 2018). 최근 피부 노화의 원인 물질로 미세먼지를 포함한 대기오염 물질과 자외선 등이 주목받고 있으며, 이들 인자는 피부 장벽에 손상을 주고 각종 염증 물질을 유발하여 산화 스트레스를 증가시킴으로써 피부 노화가 일어난다는 보고가 있다(Krutmann et al., 2014). 특히, 미세먼지는 민감성 피부에 피부염, 자극, 소양감을 유발시킬 수 있으며 건강한 피부도 피부에 처음 접촉했을 경우는 피부장벽의 보호로 아무런 반응이 없을 수도 있지만, 노출이 증가할수록 피부가 민감성 피부로 변화되어 가려움이 느껴지고, 자극이 심해지면서 피부 염증이 유발 된다(Chang, 1997). 따라서 미세먼지는 단기간의 극적인 변화보다는 장기간에 걸쳐 반복, 누적됨으로써 만성적으로 질환 및 체질변화 등으로 영향을 미칠 가능성이 크다(Lee et al., 2019).
PM10을 HaCaT 세포와 HS68 세포에 노출시켰을 때 세포독성을 확인하였으며(Ahn & Kim, 2019), 또한 미세먼지는 인체 유래 각질형성세포와 피부섬유아세포에서 IL-1β, IL-6, IL-8 등과 같은 염증성 사이토카인 발현 증가 및 IL-6, IL-8의 단백질 발현을 증가시킨다는 보고가 있다(Fermández, 2018; Park et al., 2018; Piao et al., 2018). 이 외 연구에서 피부가 미세먼지에 노출되면 염증 반응을 일으키고 피부 장벽에 손상을 주어 아토피성 피부염, 여드름, 색소침착, 건선 등의 피부질환 발생이 증가한다는 사실을 보고하고 있다(Huss et al., 2006; Kim, 2016; Kim et al., 2013). 결론적으로 미세먼지는 손상된 피부 장벽을 통해 피부 내로 침투하여 알레르기 반응, 염증 발생, 색소침착 및 피부 노화를 직접 유발한다.
PM 10에 의해 발생되는 피부 손상기전에 관한 연구는 In vitro 측면의 연구가 일부 보고되고 있으나 In vivo 측면의 연구는 미흡하다. 따라서 이 연구에서는 Hairless 마우스 피부에 PM10을 노출한 후 IL-1β와 IL-6의 염증성 사이토카인 발현을 immunohistochemistry(IHC)와 western blot을 이용하여 분석하였다. 이러한 결과는 In vivo 측면에서, 미세먼지가 피부에 지속적으로 노출되었을 때 면역이상반응, 염증 유발에 원인으로 작용하는 것을 확인할 수 있는 결과이다.
II. 재료 및 방법
1. 재료 및 제조
PM10은 미국국립표준연구소(National Institute of Standard and Technology)에서 승인한 미세먼지 표준물질(Urban dust, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)을 구입하였고(Table 1), 실험에 사용하기 위해 PM 10을 propylene glycol에 녹여 50 μg/mL 농도로 만들었다.
2. 실험동물
6주령의 SKH-1 마우스 암컷 8마리를 구입하였다(Orient Bio, Seongnam, Korea). Hairless 마우스 8마리를 일정한 온도 및 습도의 사육사에서 7일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 마우스는 대조군을 포함하여 무작위로 2개의 군(각각 N=4)으로 할당하였다. 실험동물의 사육조건은 온도 22±2°C, 습도는 50± 10%, 조명 12시간 명암으로 유지해 주었다. 동물실험은 원광학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 사전심의(승인번호: WKU20-85)를 거쳐 실행하였다. Control 군은 무처치군이며, PM 10을 처치는 hairless 마우스 등 피부 1 cm2 부위에 PM10을 10 µL씩 매일 1회 1주 동안 도포하였다(Table 2).
3. Immunohistochemistry(IHC)
사이토카인의 발현 여부를 확인하기 위해 마우스의 등 피부를 채취하여 immunohistochemistry를 실시하였다. 마우스 등 피부 조직을 4% para- formadehyde를 이용하여 4°C에서 24시간 동안 고정한 후에 1차 항체 IL-1β(Abcam, USA), IL-6(Abcam, USA)를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체에 상온에서 1시간 반응시킨 후 PBS에 3회 세척하고 Vector Elite ABC kit(Vector Laboratories, USA)을 이용하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)을 사용하여 발색시킨 후 유리 슬라이드에 옮겨 염색이 끝난 조직 표본 슬라이드를 광학현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 400배율로 촬영하였다. 영상 결과의 판독은 기관 내 대학병원에 의뢰하여 피부과 전문의 3인이 5단계로 구분하여 판독하였다. 판독기준은 Kim et al.(1998)의 연구를 참고하여 염색 강도와 상대적인 염색정도(relative abundance)에 기초하여 정하였다. Control을 0등급(Negative)으로 기준하여, 염색 강도 5~25%를 1등급(Week), 26~50%는 2등급(Mild), 51~75%는 3등급(Moderate), 76~100%는 4등급(Strong)으로 판독하였다(Table 3).
4. Western blot
채취한 마우스의 등 피부를 액화 질소를 사용하여 미세분말까지 균질화한 후 lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 nM Na2EDTA 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin]에 혼합하여 용해하였다. 이를 얼음에 30분간 둔 후 12,000 rpm, 4°C에서 원심분리하여 상층액을 취한 후 실험에 사용하였다. 수확된 단백질은 bovine serum albumin(BSA; Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)의 표준 곡선을 통해 단백질량을 보정하여 western blot 시료로 사용하였다. Sample을 12% SDS-PAGE를 이용해 전기 영동하고 이를 membrane으로 이전시킨 후, 4% skim milk에서 방치하였다. 단백질이 이전된 membrane을 β-actin(1:5,000, Bioworld, Dublin, USA), IL-1β(1:1,000, Abcam, Cambridge, UK), IL-6(1:1,000, Abcam, Cambridge, UK)에 대한 1차 항체를 4°C에서 24시간 동안 반응시킨 후 TBST로 세척하였다. 이어 2차 항체(α-rabbit, 1:1,000, Abcam, Cambridge, UK)를 1시간 동안 반응시킨 후 TBST로 세척하였다. 이후 M embrane에 ECL kit(Thermo fisher scientific, waltham, USA)를 이용하여 필름에 옮겨 측정하였다.
III. 결과 및 고찰
Hireless 마우스 등 피부에 PM10을 일주일간 지속하여 노출시킨 후 pro-inflammatory cytokine IL-1β와 IL-6의 발현을 IHC를 이용하여 분석하였다(Figure 1). 피부과 전문의 3인이 영상을 판독한 결과는 (Table 4)와 같다. Control(Negative)을 기준으로 염색강도를 판독한 결과, PM10 처치 후 IL-1β 발현 증가에 대한 score 평균은 4.00±0.00으로 4등급(strong)으로 나타났고, IL-6 발현 증가에 대한 score 평균은 3.33±0.57로 3등급(Moderate)로 나타났다.
IL-1β에 대한 western blot 결과는 (Figure 2)와 같다. Hairless 마우스 등 피부에 일주일간 PM10을 처치하였을 때 IL-1β의 발현이 증가하였다(**P<0.01). 미세먼지에 의해 유발된 IL-1β의 발현을 western blot에 의해 분석한 선행연구에서 각질형성세포에 PM 10을 처리하였을 때 IL-1β의 발현이 증가하였으며(Choi et al., 2018), 이러한 결과는 이 연구의 결과와 유사하다. 미세먼지는 피부에서 염증성 사이토카인의 발현을 증가시키며, 그중에서도 IL-1β는 pro-inflammatory cytokine으로 염증성 질병의 매개체로 작용한다. 손상된 피부장벽 내로 미세먼지가 침투하면 IL-1β의 발현이 증가하면서 피부 노화, 건선, 아토피성 피부염 등과 같은 피부질환을 유발한다(Kang et al., 2014).
Hairless 마우스 등 피부에 PM10을 도포하고 IL-6의 발현 정도를 western blot을 통해 측정한 결과 IL-6의 발현이 증가(*P<0.05) 되었다. IL-6는 pro-inflammatory cytokine의 일종으로 피부를 비롯한 다수의 세포에서 분비된다. 지금까지 알려진 기능은 면역계, 대사와 신경계를 조절하고 여러 가지 자가면역질환을 유발하는 것이다. 아토피피부염, 건선 환자의 피부에서 IL-6 발현이 증가되어 있는 점 등은 염증 반응 유발에 IL-6가 관여하고 있다는 증거이다. 이처럼 IL-6는 피부 면역과 염증 유발에 중요한 역할을 수행하고 있기 때문에 미세먼지와 같은 외부 유해물질이 피부에 침투했을 때 IL-6의 발현이 증가하는 것은 PM10의 피부노출에 의해 염증이 유발되는 것을 확인할 수 있다.
IV. 결 론
이 연구에서는 미세먼지가 피부에 지속적으로 노출되었을 때 피부에 염증을 증가시키는 것을 확인하기 위해 Hairless mouse 등 피부에 PM 10을 일주일간 노출한 후 pro-inflammatory cytokine IL-1β와 IL-6의 발현을 분석하였다.
사이토카인 IL-1β와 IL-6의 발현 여부를 확인하기 위해 IHC를 실시 한 결과, Control(Negative)을 기준으로 PM10 처치 후 IL-1β와 IL-6 발현이 증가하였음을 영상을 통해 확인하였다. 전문가 영상 판독 결과는 PM10 노출에 대한 IL-1β 발현이 증가에 대하여 4등급(strong)이었고, IL-6 발현 증가는 3등급(Moderate) 이었다. IL-1β에 대한 western blot 결과에서도 Hairless 마우스 등 피부에 일주일간 PM 10을 처치하였을 때 IL-1β의 발현이 증가하였고(**P<0.01). 이는 in vitro 측면에서의 각질형성세포에 PM 10을 처리하였을 때 IL-1β의 발현이 증가한 결과와 유사하게 나타났다. PM10 노출 후 Hairless 마우스 등 피부에 IL-6의 발현 또한 증가하였다(*P<0.05).
손상된 피부장벽 내로 미세먼지가 침투하면 IL-1β의 발현이 증가하면서 피부 노화, 건선, 아토피성 피부염 등과 같은 피부 질환을 유발되며, IL-6 또한 아토피피부염, 건선 환자의 피부에서 발현이 증가되어 있는 점 등을 고려한다면 미세먼지의 피부 염증을 유발시키는 것을 확인할 수 있다.
이상의 결과를 보았을 때 in vivo 측면에서, 미세먼지의 노출이 피부면역에 영향을 미치며 염증을 유발하는 작용이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 향후, 미세먼지가 노출되어 발생하는 알레르기 반응, 염증 반응 등의 피부 손상을 억제하기 위한 효능 원료의 발굴 및 항오염 화장품의 개발이 후속되어야 할 것이다.
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