∗Corresponding author: Sang Mo Kang I. 서 론
최근 산업화에 의한 대기오염, 삶의 질과 건강에 대한 관심증가로 인해 기능성 화장품에 대한 관심이 늘어가고 있다. 화장품법에서 기능성 화장품의 정의는 피부의 미백과 주름 개선에 도움, 자외선으로부터 피부를 보호, 모발 색상 변화·제거 또는 영양공급, 피부나 모발의 기능 약화로 이를 방지하거나 개선하는데 도움을 주는 화장품을 말한다(Cosmetics Act, 2020). 이 중 기능성 화장품 산업에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 분야는 미백과 노화 방지 화장품이다(Won et al., 2012).
먼저 기능성 화장품의 미백작용은 멜라닌 생성과 연관된 유전자의 억제, 멜라닌 생성과 관련된 효소인 tyrosinase의 전사후 처리 억제, tyrosinase의 활성 억제, 멜라노좀의 이동 억제, 턴오버 주기의 촉진 등을 통해 이루어진다(Ebanks et al., 2009). 그 중 tyrosinase의 활성을 억제하는 물질을 화장품에 첨가하여 미백 기능성 화장품으로서 활용되고 있다. Tyrosinase는 amino acid의 일종인 tyrosine을 산화시켜 멜라닌의 전구체를 생성한다. 오염물질과 호르몬, 자외선 노출 등 외부 자극이 일어난 경우 피부에는 반응성이 높은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되는데, tyrosinase는 이러한 ROS를 이용하여 tyrosine을 산화시킨다. 이때 ROS가 다량 생성된 경우 급격히 증가한 멜라닌 생성으로 인해 색소 침착이나 피부 흑화 등, 노화의 원인으로 작용한다(Costin & Hearing, 2007; Scharffetter-Kochanek et al., 1993; Sung & Kim, 2005). 이에 tyrosinase 활성 억제를 통해 기미, 주근깨, 점 등 피부의 색소 침착을 막을 수 있어, tyrosinase 활성 억제는 미백 효능에 결정적인 역할을 한다(Lee et al., 1999). 이러한 이유로 tyrosinase 억제제는 미백과 관련되어 화장품 산업에서도 점점 중요하게 여겨지고 있고, melanin 생합성 과정에서 중요한 역할을 하므로 tyrosinase 억제제를 피부의 melanin 색소 생성 조절 물질로 사용한다(Imokawa & Mishima, 1980; Imokawa & Mishima, 1981; Ohyama & Mishima, 1993). Tyrosinase 억제제로는 항산화 물질이 널리 연구되고 있다. 이는 항산화 물질의 ROS 소거 효과, tyrosine의 산화 반응 방지 효과가 결과적으로 미백 효능을 나타내기 때문인데 이러한 이유로 다양한 항산화제가 미백 성분으로서 활용되고 있다(Jang et al., 1997; Smith, 1999).
한편 피부 노화 및 주름 생성의 요인은 다양하지만 크게 대사산물의 과생산, 유전자 결함, 호르몬 불균형 등에 의한 내인성 노화와 자외선, 공기 오염 등의 체외의 요인인 외인성 노화로 나뉘어진다(Poljšak et al., 2012). 이런 요인들에 의해 생성된 ROS가 진피층의 단백질을 분해하는 MMPs(Matrix metalloproteinases)의 합성을 촉진하여 노화를 유발하고 탄력을 감소시키는 것으로 알려져 있다(Fisher et al., 1996; Kohen, 1999; Poljšak & Dahmane, 2012; Valentina et al., 2009). 이에 피부 건강 및 노화 방지를 위해 중간 매개체인 ROS를 소거하고자 기능성 화장품에 다양한 항산화 물질을 첨가한다.
항산화 물질에 대한 개발은 건강기능식품 및 화장품 산업에서 중요한 요소로 여겨지고 있으며, 특히 인체에 무해 하며 강한 항산화 효과를 나타내는 천연 항산화제의 연구에 관심이 모아지고 있다(McCord & Fridovich, 1969; Kim et al., 2010). 그 중에서도 해조류는 높은 항산화능을 지니고 있어, 화장품 산업에 사용되는 소재로서 높은 가능성을 보인다(Dizdaroglu et al.,2002; Kim et al., 1997).
해조류는 주로 광합성 색소에 따라 갈조류, 녹조류, 홍조류로 나뉘는데 갈조류는 해조류 중에서도 가장 발달한 시스템을 가지고 있다고 알려져 있다(Lee et al., 2011; Mekinić et al.,2019). 갈조류는 다양한 생리활성효과가 나타나는 phycocolloid, fucoidan, phlorotannins을 가지고 있으며, 항산화능, 페놀 성분, tyrosinase 활성 억제능이 높아 산화적 손상을 줄이는데 주로 이용된다(Dang et al., 2018; Halliwell & Gutteridge, 1986). 갈조류의 phlorotannins은 phloroglucinol(1,3,5-trihydroxybenzene)을 기본구조로 하는 갈조류만의 독특한 폴리페놀 2차 대사산물을 포함하고 있어 기능성 식품, 화장품, 생활 건강 소재 등 다양한 용도로 개발의 가능성이 큰 소재이다(Ferreres et al., 2012; Proestos & Varzakas, 2017). 그럼에도 불구하고 갈조류 추출물에 관한 연구는 매우 드물며 갈조류를 대상으로 한 항산화 관련 연구 논문과 미백 등의 기능성 화장품 소재 가능성에 관한 논문 또한 미비한 실정이다.
이에 본 연구는 갈조류 중 하나인 Dictyopteris spp.의 참가시그물바탕말(Dictyopteris pacifica), 가시뼈대그물말(Dictyopteris prolifera), 미끈뼈대그물말(Dictyopteris divaricata) 추출물에 대한 항산화 활성과 미백 효능를 실험하여 항산화 및 미백효과가있는 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 평가하고자 하였다.
II. 재료 및 방법
1. 시약 및 시료 준비
Total phenolic contents assay에 사용된 Folin-Ciocâlteu reagent, gallic acid, sodium carbonate, trichloroacetic acid는 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였다.
DPPH assay에 사용된 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)은 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였다.
ABTS assay에 사용된 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), manganese dioxide는 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였다.
Nitric oxide(NO) assay에 사용된 sulfanilamide, naphthylethyl-enediamine dihydrochloride는 TCI(Japan)에서, phosphoric acid는 Junsei(Japan)에서 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 Dictyopteris spp. 추출물은 해양수산부의 해양생명자원 정보 표준화 및 통합 데이터베이스 시스템인 해양생명자원 정보시스템(Marine Bio-Resource Information System, MBRIS)를 통해 분양받아 사용하였다.
2. Total phenolic contents 측정 방법
Total phenolic contents는 Folin & Denis(1912)의 실험 방법을 변형하여 사용하였다. 각 추출물은 1.0 mg/mL 농도로 70% ethanol로 희석하여 사용하였다. NaCO3 포화용액은 증류수에 과량의 sodium carbonate를 용해 시킨 뒤, Whatman no. 2 filter paper를 이용하여 녹지 않은 sodium carbonate를 제거하였다. 추출물 0.02mL와 Folin-Ciocâlteu reagent 0.01 mL, sodium carbonate 포화용액 0.06 mL를 micro tube에 주입한 뒤 15분간 반응시켰다. 그 후 증류수 0.20 mL를 주입하여 원심분리 후 상층액을 분리하였다. 반응물은 UV-vis spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro, GE Healthcare, USA)를 이용하여 740 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 gallic acid를 사용하였다.
3. DPPH radical scavenging activity 측정 방법
DPPH radical scavenging activity는 Blois(1958)의 방법에 준하여 항산화력을 측정하였다. 예비 실험을 통해 범위 내에서 30~70% 소거능을 보이도록 사용농도를 1.25~20 mg/mL 로 설정하였고 각 추출물은 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 mg/mL의 농도가 되도록 70% ethanol로 희석하여 사용하였다. DPPH는 95% ethanol에 희석하여 540 nm에서 흡광도가 0.5가 되도록 조정하였다. 추출물 용액 0.20 mL와 DPPH 용액 1.80 mL를 test tube에 주입 후 혼합하여 30분간 반응시켰다. 반응물은 UV-vis spectrophotometer(Ultrospec 3100 pro, GE Healthcare, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical scavenging activity는 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 아래와 같이 백분율로 표시하였다.
4. ABTS radical scavenging activity 측정 방법
ABTS radical scavenging activity는 Re(1999)의 방법을 수정하여 항산화력을 측정하였다. 예비 실험을 통해 범위 내에서 30~70% 소거능을 보이도록 사용농도를 1.25~20 mg/mL로 설정하였고 각 추출물은 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 mg/mL의 농도로 70% ethanol로 희석하여 사용하였다. ABTS는 2.5 mM 농도로 pH 7.40인 5mM PBS에 희석한 뒤 oxidizing agent로서 manganese dioxide를 첨가하여 발색시켰다. 720 nm에서 흡광도가 0.6 이상이 되도록 발색이 되면 Whatman no. 2 filter paper를 이용하여 manganese dioxide를 제거한 후 흡광도가 0.5가 되도록 pH 7.40인 5 mM PBS으로 희석하였다. 추출물 용액 0.20 mL와 ABTS 용액 1.80 mL를 test tube에 주입 후 혼합하여 30분간 반응시켰다. 반응물은 UV-vis spectrophotometer(Ultrospec 3100 pro, GE Healthcare, USA)를 이용하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical scavenging activity는 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 아래와 같이 백분율로 표시하였다.
5. Nitric oxide radical scavenging activity 측정 방법
예비 실험을 통해 범위 내에서 30~70% 소거능을 보이도록 사용농도를 1.25~20 mg/mL로 설정하였고 각 추출물은 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 mg/mL의 농도가 되도록 70% ethanol로 희석하여 사용하였다. NO radical scavenging activity는 griess reagent를 이용하여 측정하였다(Green et al., 1982). Griess reagent는 1% sulfanilamide를 5% phosphoric acid에 녹인 것과 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride 수용액을 1: 1 비율로 혼합한 것을 사용하였다. NO 생성 물질로는 0.1 M sodium nitrite 용액을 사용하였으며, 이를 희석하여 아래의 실험 방법을 통해 흡광도 1.0이 나오도록 보정하였다.
Sodium nitrite용액 0.9 mL와 추출물 0.1 mL를 혼합 후 30분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 용액 중 상층액 0.1 mL와 griess reagent 0.1 mL를 혼합하여 15분간 동안 발색이 이루어지도록 반응시켰다. 그 후 540nm 흡광도를 측정하였다. 540 nm 흡광도는 생성된 NO의 양과 비례한다.
NO radical scavenging activity의 계산은 다음과 같이 계산하였다.
6. Tyrosinase inhibition activity 측정 방법
Tyrosinase inhibition activity 측정은 선행 연구(Jo et al., 2003)의 방법에 준하여 측정하였다. 각 추출물의 미백 활성을 알아보기 위해 tyrosinase inhibition activity를 측정하였다. 반응은 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.5)에 기질인 2 mM L-tyrosine solution 및 시료 용액(1 mg/mL)의 혼합액을 mushroom tyrosinase(1,000 unit/ml) 효소와 degassed 증류수를 첨가하여 25 °C에서 30분간 반응시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 추출물 대신 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) 20 μl를 첨가하여 흡광도를 측정한 값을 기록 후 다음의 식에 의해 계산하였다.
저해율(%) = (Control - Sample) / Control)×100
7. 세포 독성 측정 방법
세포에 독성이 미치는 정도를 확인하기 위해 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하여 측정하였다(Mosmann, 1983). 세포 독성 실험에는 B16F10 cell line(한국세포주은행, 한국)을 사용하였다. 세포 배양에 사용된 배지는 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, GE healthcare, USA), fetal bovine serum(FBS, Sigma, USA), penicillin-streptomycin solution(Sigma, USA)를 사용하였다. DMEM 445 mL, FBS 50 mL, penicillin-streptomycin solution 5 mL를 혼합하여 배지를 제조하였다. 추출물을 첨가한 배지는 DMEM용액을 용매로 하여 1 mg/mL 농도로 제조하였다. 96 well plate에 각 well 당 3.0×104 cell을 seeding하여 1일간 37 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 배양하였다. 배양 후 상층액을 회수한 뒤 DMEM 배지 0.180 mL와 추출물을 첨가한 배지를 0.020 mL 주입하여 다시 2일간 배양하였다. 배양 후 추출물을 첨가한 배지를 회수한 뒤 MTT solution을 0.100 mL씩 처리하여 4시간 동안 결정화시켰다. 그 후 MTT solution을 다시 제거한 뒤, DMSO 0.100 mL를 처리하여 결정화된 MTT를 다시 용해시켜, 550 nm 흡광도를 통해 결정화된 MTT의 양을 측정하였다. MTT의 결정 생성은 NADH의 양과 비례하며, 생존한 세포 수에 비례한다. 세포 생존율의 계산은 다음과 같이 계산하였다.
8. B16F10 melanoma cell의 melanin contents 측정 방법
Melanin contents 측정 실험에는 B16F10 melanoma cell을 사용하였다. 세포 배양에는 DMEM, FBS, penicillin-streptomycin solution을 사용하였으며, melanin 생성을 유도하기 위하여 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH, Sigma, USA)을 사용하였다. DMEM 470 mL, FBS 25 mL, penicillin-streptomycin solution 5 mL를 혼합하여 배지를 제조하였다. 추출물을 첨가한 배지는 DMEM용액을 용매로 하여 1 mg/mL 농도로 제조하였다.
96 well plate에 각 well 당 5.0×104 cell을 seeding하여 1일간37 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 배양하였다. 배양 후 상층액을 회수한 뒤 ɑ-MSH가 0.1 μg/mL 농도로 첨가된 DMEM 배지 0.180 mL와 추출물을 첨가한 배지를 0.020 mL 주입하여 다시 4일간 배양하였다. 배양 후 405 nm 흡광도를 측정하였다. 405 nm 흡광도는 생성된 melanin의 양과 비례한다.
생성된 melanin contents는 다음과 같이 계산하였다.
III. 결과 및 고찰
1. Total phenolic contents
다양한 antioxidant가 함유되어 있는 천연물 추출물에는 종류에 따라 차이가 있으나 phenolic content가 차지하는 비율이 높음으로 phenolic content의 양을 측정해 추출물의 항산화능을 유추할 수 있다(Singleton & Rossi, 1965).
이에 Dictyopteris spp.의 total phenolic contents를 측정하였다. Dictyopteris spp.의 total phenolic contents를 측정한 결과 Fig. 1과 같다. Dictyopteris spp. 중 1 mg/mL에서 D. pacifica 추출물은 127.16±1.06 mg gallic acid/g, D. prolifera 추출물은 90.50±2.16 mg gallic acid/g, D. divaricata 추출물은 301.25±1.38 mg gallic acid/g의 결과를 보였다. Dictyopteris spp. 추출물의 total phenolic contents의 농도를 ANOVA를 통해 비교한 결과 D. divaricata 추출물 > D. pacifica 추출물 > D. prolifera 추출물로나타났다(p<0.001). D. divaricata 추출물의 결과는 D. pacifica 추출물의 수치보다 174.1%의 차이로 2.7배 높게 측정되었고, D. prolifera 추출물에 비해 210.7% 차이로 3.3배 높게 나타나 Dictyopteris spp. 중 가장 높은 total phenolic contents 함량을 가진 추출물로 확인되었다.
Fig. 1.
Total phenolic contents of Dictyopteris spp. 70% ethanol extract (Gallic acid used as standard). Abbreviations: D1, D. pacifica extract; D2, D. prolifera extract; D3, D. divaricata extract.
선행논문(Kim et al., 2006)에서 해조류 7종의 total phenolic contents을 측정한 결과 구멍쇠미역(Agarum cribrosum)은 10.84 mg/g, 곰피(Ecklonia stolonifera)는 2.44 mg/g, 지누아리(Grateloupia filicina)는 1.57 mg/g, 재래종다시마(Kjellmaniella crassifolia)는 1.12 mg/g, 김(Porphyra tenera)은 0.35 mg/g, 괭생이모자반(Sargassum horneri)은 7.22 mg/g, 고리매(Scytosiphon lomen-taria)는 0.37 mg/g를 보였다. 이 중 갈조류에 해당하는 구멍쇠미역(Agarum cribrosum)과 괭생이모자반(Sargassum horneri)은 각각 10.84 mg/g과 7.22 mg/g으로 나타났고 본 실험에서 취급한 3종의 추출물은 앞선 연구의 해조류 7종의 결과와 비교했을때 모두 높은 수치를 보였다. 특히 D. divaricata 추출물의 301.25±1.38 mg gallic acid/g 결과는 갈조류 중에서 함량이 가장 높다고 나타난 구멍쇠미역(Agarum cribrosum)의 10.84 mg/g에 비해 27.8배 높게 나타나 total phenolic contents 함유량이 매우 높은 것으로 나타났다.
2. DPPH radical scavenging activity
Dictyopteris spp. 추출물의 DPPH radical scavenging activity 을 보기 위해 Dictyopteris spp.을 희석하여 DPPH 용액에 반응시켜 측정하였다. Dictyopteris spp.의 DPPH radical scavenging activity을 측정한 결과 추출물의 농도와 radical scavenging activity이 비례한 결과를 보였다(Fig. 2). D. pacifica 추출물은 1.25 mg/mL에서 14.80±4.00%, 2.5 mg/mL에서 21.53±1.80%,5.0 mg/mL에서 42.73±2.95%, 10 mg/mL에서 83.20±5.26%, 20 mg/mL에서 96.33±1.95%의 radical scavenging activity를 보였다. D. prolifera 추출물은 1.25 mg/mL에서 8.00±4.26%, 2.5 mg/mL에서 8.67±3.04%, 5.0 mg/mL에서 15.20±4.55%, 10 mg/mL 에서 22.87±1.20%, 20 mg/mL에서 48.93±4.96%의 radical scavenging activity를 보였다. D. divaricata 추출물은 1.25 mg/mL에서 61.40±6.45%, 2.5 mg/mL에서 96.40±0.75%, 5.0 mg/mL에서 97.33±0.25%, 10 mg/mL에서 98.40±0.28%, 20 mg/mL 에서 99.40±0.16%의 radical scavenging activity를 보였다. 결과값이 가장 높은 20 mg/mL 농도를 기준으로 DPPH radical scavenging activity를 ANOVA를 통해 비교한 결과 D. divaricata 추출물 = D. pacifica 추출물 > D. prolifera 추출물로 나타났다(p<0.001).
Fig. 2.
DPPH radical scavenging activity of Dictyopteris spp. 70% ethanol extract. Abbreviations: D1, D. pacifica extract; D2, D. prolifera extract; D3, D. divaricata extract.
2.5 mg/mL 농도에서 D. divaricata 추출물은 96.40±0.75%로 D. pacifica 추출물의 21.53±1.80%에 비해 4.5배 높고, D. prolifera 추출물의 8.67±3.04%에 비해 11.1배의 차이를 보여, D. divaricata 추출물이 Dictyopteris spp. 중에서도 가장 뛰어난 DPPH radical scavenging activity를 나타냈다. 그리고 D. pacifica 추출물은 20 mg/mL 농도에서 96.33±1.95%로 높은 DPPH radical scavenging activity를 보였는데, 20 mg/mL 농도의 D. prolifera 추출물의 48.93±4.96%과 비교했을 때 47.4% 차이가있어 2.0배 높은 DPPH radical scavenging activity를 보였다. Dictyopteris spp. 중 D. divaricata 추출물이 가장 높은 DPPH radical scavenging activity를 보였다. 이 수치는 해조류 5종의 DPPH radical scavenging activity을 실험한 선행연구(Kwak et al., 2005) 중 2.5 mg/mL 농도에서 26.80% 결과로 가장 효과가 높았던 다시마(Laminaria japonica)와 비교하였을 때 D. divaricata 추출물은 2.5 mg/mL에서 96.40%의 효과를 보여 3.6배 높은 항산화능 효과를 나타내었다.
3. ABTS radical scavenging activity
ABTS radical scavenging activity 경우 소수성 물질과 친수성 물질의 antioxidative activity 측정이 가능하므로 일반적으로 DPPH radical scavenging activity보다는 높은 활성을 나타낸다(Re et al., 1999).
Dictyopteris spp.의 ABTS radical scavenging activity을 보기 위해 Dictyopteris spp.을 희석하여 ABTS 용액에 반응시켜 측정하였다. Dictyopteris spp.의 ABTS radical scavenging activity 을 측정한 결과, 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS radical scavenging activity 또한 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3). D. pacifica 추출물은 1.25 mg/mL에서 1.47±1.05%, 2.5 mg/mL에서 4.40±1.80%, 5.0 mg/mL에서 9.13±2.29%, 10 mg/mL에서 15.33±0.62%, 20 mg/mL에서 33.60±1.50%의 radical scavenging activity를 보였다. D. prolifera 추출물은 1.25 mg/mL에서 7.93±1.81%, 2.5 mg/mL에서 15.07±1.55%, 5.0 mg/mL에서 31.00±2.05%, 10 mg/mL에서 61.47±2.49%, 20 mg/mL에서 97.80±0.28%의 radical scavenging activity를 보였다. D. divaricata 추출물은 1.25 mg/mL에서 24.87±1.60%, 2.5 mg/mL에서 47.80±0.75%,5.0 mg/mL에서 96.73±0.41%, 10 mg/mL에서 97.67±0.90%, 20 mg/mL에서 98.87±0.62%의 radical scavenging activity를 보였다. 결과값이 가장 높은 20 mg/mL 농도를 기준으로 ABTS radical scavenging activity를 ANOVA를 통해 비교한 결과 D. divaricata 추출물 = D. prolifera 추출물 > D. pacifica 추출물로 나타났다(p<0.001).
Fig. 3.
ABTS radical scavenging activity of Dictyopteris spp. 70% ethanol extract. Abbreviations: D1, D. pacifica extract; D2, D. prolifera extract; D3, D. divaricata extract.
5.0 mg/mL 농도에서 D. divaricata 추출물은 96.73±0.41로 D. pacifica 추출물의 9.13±2.29%에 비해 10.6배의 높은 결과를 보였고, D. prolifera 추출물의 31.00±2.05%에 비해서는 65.7%의 차이로 3.1배 높아 D. divaricata 추출물이 가장 뛰어난 ABTS radical scavenging activity를 보였다. 그리고 20 mg/mL 농도에서 D. pacifica 추출물은 33.60±1.50%의 ABTS radical scavenging activity를 보였는데, 같은 농도에서 D. prolifera 추출물은97.80±0.28%로 측정되어 D. pacifica 추출물보다 2.9배 높은 ABTS radical scavenging activity를 보였다. Dictyopteris spp. 중 D. divaricata 추출물이 가장 높은 ABTS radical scavenging activity를 보였다.
D. divaricata 추출물의 수치는 갈조류 10종의 항산화능을 실험한 선행연구(Lee et al., 2020)와 비교하였을 때 높은 수치를나타내었는데, 선행 연구의 갈조류 10종 항산화 측정 결과 높은 순으로 보면 넓패(Ishige foliacea) 178.45%, 검둥모자반(Sargassum nigrifolium) 80.85%, 쏭이모자반(Sargassum confusum)23.25%, 톳(Sargassum fusiforme) 21.92%, 바위주름(Petrospongium rugosum) 20.85%, 개미역쇠(Petalonia fascia) 20.32%, 잘록이고리매(Scytosiphon lomentaria) 18.72%, 바위수염(Myelophycus simplex) 16.85%, 경단구슬모자반(Sargassum muticum) 15.25%, 가는미역실(Scytosiphon gracilis) 10.99%로 각각 나타났다. D. divaricata 추출물의 98.87%는 178.45%의 수치로 가장 높은 결과가 나온 넓패(Ishige foliacea) 다음으로 높게 나타나 연구된 10종의 갈조류 중에서도 항산화능 효과가 높게 측정되었다. D. prolifera 추출물 또한 97.80±0.28%의 결과로 Dictyopteris spp. 3종의 추출물 중 2종의 추출물이 높은 측정 결과를 나타내 항산화능이 뛰어난 소재임을 확인할 수 있었다.
4. Nitric oxide radical scavenging activity
NO는 적정한 농도에서 혈관의 확장, 향균, 신경의 신호전달, 항암효과를 지니는데 NO에 만성적으로 노출되었을 때 reactive oxygen species와 반응하여 높은 독성의 ONOO−가 생성될 가능성이 높아진다(Amaeze et al., 2011; Bhaskar & Balakrishnan, 2009). NO 또한 reactive oxygen species와 마찬가지로 항산화물질에 의해 소거된다고 알려져 있다(Lakhanpal & Rai, 2007).
이에 Dictyopteris spp.의 NO radical scavenging activity을 보기 위해 Dictyopteris spp. 추출물을 용액에 반응시켜 측정하였다. Dictyopteris spp.의 NO radical scavenging activity을 측정한 결과 Fig. 4와 같다.
Fig. 4.
Nitric oxide radical scavenging activity of Dictyopteris spp.70% ethanol extract. Abbreviations: D1, D. pacifica extract; D2, D. prolifera extract; D3, D. divaricata extract.
D. pacifica 추출물은 1.25 mg/mL에서 5.30±1.72%, 2.5 mg/mL에서 8.47±1.72%, 5.0 mg/mL에서 14.97±1.81%, 10 mg/mL 에서 28.20±2.37%, 20 mg/mL에서 51.93±1.64%를 보였다. D. prolifera 추출물은 1.25 mg/mL에서 6.37±1.46%, 2.5 mg/mL에서 9.47±0.69%, 5.0 mg/mL에서 19.77±2.09%, 10 mg/mL에서37.50±2.37%, 20 mg/mL에서 71.73±1.88%를 보였다. D. divaricata 추출물은 1.25 mg/mL에서 7.83±2.53%, 2.5 mg/mL 에서 10.27±0.62%, 5.0 mg/mL에서 20.07±1.11%, 10 mg/mL에서 37.93±0.40%, 20 mg/mL에서 76.80±1.27%를 보였다. 결과값이 가장 높은 20 mg/mL 농도를 기준으로 NO radical scaven-ging activity를 ANOVA를 통해 비교한 결과 D. divaricata 추출물 > D. prolifera 추출물 > D. pacifica 추출물로 나타났다(p<0.001).
20 mg/mL 농도에서 D. pacifica 추출물은 51.93±1.64%의 결과가 나타났는데 같은 농도의 D. prolifera 추출물의 71.73±1.88%, D. divaricata 추출물의 76.80±1.27% 비해서는 각각 1.4배, 1.5배 낮은 수치로 3종의 추출물 중 가장 낮은 NO radical scavenging activity를 보였다. NO radical scavenging activity에서 가장 높은 측정 결과를 보인 추출물은 76.80±1.27%의 D. divaricata 추출물로 확인되었다.
해조류 35종 추출물의 nitrite 소거활성 평가(Ahn et al., 2011)의 연구 논문 내용 중 갈조류 17종 감태(Ecklonia cava), 곰피(Ecklonia stolonifera), 패(Ishige okamurai), 불레기말(Colpo-menia sinuosa), 쇠미역(Costaria costata), 대황(Eisenia bicyclis), 톳(Hizikia fusiforme), 넓패(Ishige foliacea), 다시마(Laminaria japonica Areschong), 알쏭이모자반(Sargassum confusum), 모자반(Sargassum fulvellum), 짝잎모자반(Sargassum hemiphyllum), 괭생이모자반(Sargassum horneri), 지충이(Sargassum thunbergii), 야마자모자반(Sargassum yamade), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 미역(Undaria pinnatifida)의 NO radical scavenging activity 경우 11종이 70% 이상의 활성을 나타내었다고 보고되었다. 같은 실험에서 홍조류에서는 11종 중 1종에서만 82.80%활성이 나타나고 녹조류 7종에서는 모든 시료가 65% 이상의 활성을 보여 갈조류가 다른 해조류 종류에 비해 NO radical scavenging activity이 높음을 알 수 있었다.
본 실험 연구 결과 또한 D. prolifera 추출물이 71.73%, D. divaricata 추출물이 76.80%의 수치로 선행 연구의 결과와도 유사하여 Dictyopteris spp. 추출물이 높은 radical scavenging activity를 나타냄을 추측할 수 있었다.
5. Tyrosinase inhibition activity
미백 효능 확인을 위해 tyrosinase 저해 활성을 측정하여 미백 물질을 탐색 할 수 있다(Ha, 2009). 이에 Dictyopteris spp.의 tyrosinase inhibition activity를 측정한 결과 Fig. 5와 같다. Dictyopteris spp. 중 1 mg/mL에서 D. pacifica 추출물은 15.2±2.1%, D. prolifera 추출물은 43.5±1.5%, D. divaricata 추출물은 40.1±2.0%의 결과를 보였다. Dictyopteris spp. 추출물의 1 mg/mL 농도에서의 Tyrosinase inhibition rate를 ANOVA를 통해 비교한 결과 D. divaricata 추출물 = D. prolifera 추출물 > D. pacifica 추출물로 나타났다(p<0.001). D. prolifera 추출물의 결과는 D. pacifica 추출물의 수치보다 28.3%의 차이로 2.9배 높게 측정 되었고 D. divaricata 추출물은 D. pacifica 추출물의 결과보다 24.9% 차이로 2.6배 높게 나타나 Dictyopteris spp. 추출물 중 D. prolifera 추출물이 가장 높은 tyrosinase inhibition activity를 보였다. 앞선 항산화 측정 실험에서 D. divaricata 추출물이 높은 결과가 나온 것과 달리 tyrosinase inhibition activity 측정에서는 D. prolifera 추출물이 높은 활성을 보인 것으로 나타났다.
Fig. 5.
Tyrosinase inhibition activity of Dictyopteris spp. 70% ethanol extract. Abbreviations: D1, D. pacifica extract; D2, D. prolifera extract; D3, D. divaricata extract.
Lee(2013)은 해조류 4종의 에탄올 추출물로 tyrosinase 억제활성을 분석한 결과 김(Porphyra tenera)은 25.93%, 미역(Undaria pinnatifida) 26.32%, 다시마(Laminaria japonica Areschoug) 24.76%, 톳(Hizikia fusiformis) 20.24%의 활성을 나타냈다고 보고하였다. 4종의 해조류 추출물 중 가장 높은 tyrosinase 억제 활성 결과를 보인 추출물은 갈조류에 해당하는 미역(Undaria pinnatifida)으로 확인되었다.
본 연구의 D. prolifera 추출물 43.5±1.5%와 D. divaricata 추출물의 40.1±2.0% 결과는 선행연구에서 가장 높은 억제 활성이 나타난 미역(Undaria pinnatifida)의 26.32% 결과보다 각각 1.7배, 1.5배 높아 Dictyopteris spp. 추출물이 우수한 tyrosinase inhibition activity을 보인 것을 확인하였다.
6. 세포 독성
B16F10 melanoma cell에 Dictyopteris spp. 추출물을 0.1 mg/mL 첨가하여 배양한 후 MTT assay를 수행하였다. MTT assay 측정은 세포에서 미토콘드리아의 NADH 의존적인 산화환원효소가 노란색을 띄는 MTT 용액을 환원시켜 보라색의 formazan 을 형성하는 것을 흡광도로 측정하는 방법이다(Wang et al., 2004). Dictyopteris spp. 추출물의 세포 생존율을 측정한 결과는 다음과 같다(Fig. 6). 세포 생존율을 측정한 결과 D. pacifica 추출물 97.76±0.37%, D. prolifera 추출물 89.24±1.13%(p<0.01), D. divaricata 추출물 80.96±1.25%의 결과가 나타났다(p<0.01). 3종의 Dictyopteris spp. 추출물 모두 80% 이상의 높은 세포 생존율을 보였고, 이에 B16F10 melanoma cell을 활용한 melanin contents 측정 실험을 진행하였다.
7. B16F10 melanoma cell의 melanin contents
α-MSH와 같은 외부요인이 melanoma cell을 자극하게 되면 melanin화가 촉진되어 melanin 합성이 일어난다(Jeon et al., 2013). 이에 세포 내 melanin 생합성 억제 효과 확인을 위해 α-MSH에 유도된 B16F10 melanoma cell에 각 추출물을 0.1 mg/mL 농도로 처리하여 melanin contents를 측정한 결과는 다음과 같다(Fig. 7). LPS를 처리한 대조군(control)을 100%로 보았을때 Dictyopteris spp.의 melanin contents는 각각 D. pacifica 추출물 33.9%(−66.1%), D. prolifera 추출물 36.32%(−63.68%), D. divaricata 추출물 42.7%(−57.3%)의 수치로 3종 추출물 모두 통계적으로 유의미한 결과를 보였다(모두 p<0.001). D. pacifica 추출물은 66.1% melanin 생성량을 감소시켰으며, 같은 농도의 D. divaricata 추출물에 비해 1.2배 높은 결과를 보여 Dictyopteris spp. 중 가장 우수한 melanin 생성 저해 효능을 보였다. 앞선 선행 연구(Jeon et al., 2013)에서 88종 해조류의 melanin 생성 저해율 측정 실험 중 효능이 확인된 5종에 대해서만 결과를 나타내었는데 모두 갈조류로 확인되었다. 이는 해조류 중에서도 갈조류 추출물이 melanin 생성 저해율이 우수함을 의미한다. 본 실험과 같은 0.1 mg/mL 농도로 melanin contents를 보았을때, 고리매(Scytosiphon lomentaria) 80.9%(−19.1%), 미역쇠(Endarachne binghamiae) 47.1%(−52.9%), 왜모자반(Sargassum yezoense) 87.1%(−12.9%), 감태(Ecklonia cava) 90%(−10%), 톳(Sargassum fusiforme) 63%(−37%)의 결과를 보였다. 가장 높은 저해율을 보인 미역쇠(Endarachne binghamiae) 47.1%(−52.9%)에 비교 하였을 때, 본 실험의 Dictyopteris spp. 추출물 모두 33.9%(−66.1%), 36.32%(−63.68%), 42.7%(−57.3%) 결과로 갈조류 중에서도 Dictyopteris spp. 추출물이 melanin 저해율이 높아 미백 효능이 있는 소재로서의 개발 가능성이 있음을 시사 한다.
Fig. 7.
Effects of Dictyopteris spp. 70% ethanol extracts on melanin production of B16F10 cells. Abbreviations: D1, D. pacifica extract; D2, D. prolifera extract; D3, D. divaricata extract.
화장품 원료로서의 항산화능은 피부 건강을 증진시키는 요소일 뿐만 아니라 제품의 보존성 및 생산성, 기능성 화장품의 기능성에도 영향을 준다. 또한, 단백질 분해 효소인 MMPs의 합성을 촉진시키며, 높은 산화력을 가지는 ROS를 소거하여 피부 건강 및 노화 방지를 위해 기능성 화장품에 다양한 항산화물질을 첨가한다(Fisher et al., 1996). 피부의 ROS 감소는 광노화를 예방하고 최소화시키기 위해 촉망되는 전략임은 분명하며(Park et al., 2010), 항산화능 측정은 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토하는 연구에 필수적이다.
다양한 항산화 활성측정법 중 본 연구에서는 total phenolic contents, DPPH, ABTS, NO radical scavenging activity 측정법을 적용하였고, 미백 효능을 위해 tyrosinase inhibition activity, melanin contents 측정 실험을 하였다. total phenolic contents, DPPH, ABTS, NO radical scavenging activity 항산화 측정 결과 4가지의 실험 모두 D. divaricata 추출물이 각각 301.25±1.38 mg gallic acid/g, 99.40±0.16, 98.87±0.62, 76.80±1.27%를 보여 가장 높은 항산화능을 보였다. Tyrosinase inhibition activity 측정에서는 D. prolifera 추출물이 43.5±1.5% 결과로 3종의 추출물 중 가장 높은 저해 활성을 보였고, melanin contents 측정에서는 D. pacifica 추출물이 33.9%(−66.1%) 결과로 멜라닌 생성저해율이 가장 높았다.
Tyrosinase inhibition activity 측정에서 가장 높은 저해 활성을 보인 D. prolifera 추출물을 중심으로 보면 total phenolic contents, DPPH radical scavenging activity에서 3종의 Dictyopteris spp. 추출물 중 가장 낮은 값을 보였고, D. divaricata 추출물은 가장 높은 활성을 보였다. ABTS radical scavenging activity에서는 D. prolifera 추출물이 D. divaricata 추출물보다는 낮고 D. pacifica 보다는 높은 중간 정도의 저해 활성 값을 보였다. 그리고 NO radical scavenging activity에서는 D. prolifera와 D. divaricata 추출물의 첨가량 10 mg/mL까지는 거의같은 값을 보였고, 20 mg/mL에서 D. divaricata 추출물이 1.1배높은 값을 보였다.
In vitro tyrosinase inhibition activity 실험에서는 1 mg/mL 농도로 실험하였는데, D. prolifera 추출물은 43.5±1.5%, D. divaricata 추출물은 40.1±2.0%로 큰 차이를 보이지 않았으며, 이러한 경향은 본 연구의 5가지 측정 실험 중, 첨가량 1.25 mg/mL에서의 NO radical scavenging activity에서도 유사하게 나타나 이 부분의 관련성에 대해서는 좀 더 검토할 필요가 있다고 판단된다. 또한, D. pacifica 추출물은 B16F10 melanoma cell에서 세포 독성이 거의 나타나지 않았고 melanin contents 측정에서 3종의 추출물 중 가장 낮은 melanin 생성을 보였다. Tyrosinase inhibition activity 실험에서 가장 낮은 저해 활성을 보인 D. pacifica 추출물이 melanin contents 측정에서 가장 높은 melanin 저해율을 보여 이 차이에 대한 추가적 검토가 필요할 것으로 보인다. 한편, D. prolifera 추출물은 tyrosinase inhibition activity 에서 가장 높은 저해 활성을 나타냈고 B16F10 melanoma cell의 melanin contents 측정에서 D. pacifica 추출물과 비슷한 결과의 melanin 저해율을 보여 Dictyopteris spp. 3종 추출물 중 미백 효능이 가장 효과적인 추출물로 사료 된다.
화장품에서의 항산화 측정 방법은 광범위한 항산화능을 측정할 수 있는 DPPH와 ABTS radical scavenging activity가 선호되는데 서로 간 측정 수치의 차이가 있어 두 방법을 모두 시행하는 것이 추천된다(Floegel et al., 2011). 따라서 DPPH와 ABTS radical scavenging activity 두 방법의 실험 측정에서 높은 결과를 보인 D. divaricata 추출물은 항산화능 기능성 화장품 소재로 활용 가능성이 있음을 보여주는 결과이다.
그러나 in vitro 실험 결과에서는 D. prolifera, D. pacifica 추출물이 D. divaricata 추출물보다 약간 더 효과적인 결과가 확인되었는데 세포독성, 세포투과력을 보이는 분자 특성 등의 또다른 제약들이 있어, 화장품 원료로 사용하기 위해서는 다음 단계로 세포실험을 하여 좀 더 피부에 맞는 화장품 원료로 타당성을 검토할 필요가 있겠다.
IV. 결 론
본 연구에서는 갈조류 중 하나인 Dictyopteris spp.의 D. pacifica, D. prolifera, D. divaricata 추출물에 대한 항산화 활성및 미백 효능 실험을 측정하여 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 알아보고자 연구를 진행하였다.
Total phenolic contents 측정 결과, D. pacifica 추출물은 127.16±1.06 mg gallic acid/g, D. prolifera 추출물은 90.50±2.16 mg gallic acid/g, D. divaricata 추출물은 301.25±1.38 mg gallic acid/g의 함유량을 보였다. D. divaricata 추출물이 301.25±1.38 %로 total phenolic contents가 매우 많이 함유되어 있음을 나타냈다.
DPPH radical scavenging activity의 측정 결과 세 추출물 모두 20 mg/mL에서 가장 높은 결과를 보였으며, D. pacifica 추출물은 96.33±1.95%, D. prolifera 추출물은 48.93±4.96%, D. divaricata 추출물은 99.40±0.16%의 결과가 나타났다. D. prolifera 추출물을 제외한 D. pacifica, D. divaricata 추출물에서 높은 radical scavenging activity 효과가 나타났다.
ABTS radical scavenging activity 측정 결과 또한 DPPH radical scavenging activity 측정 결과와 동일하게 20 mg/mL에서 가장 높은 효과를 보였다. D. pacifica 추출물은 33.60±1.50%, D. prolifera 추출물 97.80±0.28%, D. divaricata 추출물 98.87±0.62%의 radical scavenging activity을 보였다. DPPH radical scavenging activity에서 높은 효과를 나타냈던 D. pacifica 추출물은 ABTS radical scavenging activity에서 보다 낮은 효과를 보였고 D. divaricata 추출물은 DPPH, ABTS 모두 높은 radical scavenging activity가 나타났다.
NO radical scavenging activity 측정 결과, 20 mg/mL에서 D. pacifica 추출물은 51.93±1.64%, D. prolifera 추출물은 71.73±1.88%, D. divaricata 추출물은 76.80±1.27%를 나타내었다. 가장 높은 NO radical scavenging activity를 보인 것은 D. divaricata 추출물이었다.
Tyrosinase inhibition activity 측정 결과, 1 mg/mL 농도에서 D. pacifica 추출물은 15.2±2.1%, D. prolifera 추출물은 43.5±1.5%, D. divaricata 추출물은 40.1±2.0%의 결과를 보여 D. prolifera 추출물이 가장 높은 tyrosinase inhibition activity를 보였다.
세포 독성 실험에서 추출물 0.1 mg/mL 농도를 첨가하여 세포 생존율을 측정한 결과 D. pacifica 추출물 97.76±0.37%, D. prolifera 추출물 89.24±1.13%, D. divaricata 추출물 80.96±1.25%의 결과로 D. pacifica 추출물의 세포 생존율이 가장 높았다.
B16F10 melanoma cell의 melanin contents 측정 결과, 0.1 mg/mL 농도에서 D. pacifica 추출물 33.9%(−66.1%), D. prolifera 추출물 36.32%(−63.68%), D. divaricata 추출물 42.7%(−57.3%)의 결과로 D. pacifica 추출물이 가장 낮은 melanin contents를 보였다.
이와 같이 갈조류 중 하나인 Dictyopteris spp. 추출물의 항산화 활성 및 미백 효능에 대한 실험 결과를 확인하였다. 진행된 모든 실험에서 Dictyopteris spp. 추출물은 각각 항산화 및 미백효능에서 우수한 수치를 나타냈고 이러한 결과를 토대로 Dictyopteris spp. 추출물을 향후 천연 항산화제 및 미백 효능이 있는 기능성 화장품 원료로 활용하는데 필요한 기초 자료로 제시하고자 한다. 또한 현재 갈조류에 대한 연구 자체가 미비한 실정으로 화장품 원료로서의 가능성을 증명할 수 있는 추가 연구가 요구되며 해조류를 화장품 제조에 활용함에 있어 특유의 비릿한 냄새를 제거할 수 있는 연구 또한 요구됨이 사료된다.
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