녹차와 밤송이로 구성된 복합추출물의 in vitro 항여드름 효능연구

In vitro Anti-acne Properties of Plant Extract Complex Composed of Camellia sinensis L. Leaf and Castanea crenata Bur

Article information

J Korean Soc Cosmetol. 2023;29(1):107-114
Publication date (electronic) : 2023 February 28
doi : https://doi.org/10.52660/JKSC.2023.29.1.107
1Junior Research Scientist, R&D Center, Biospectrum Life Science Institute
2Senior Research Scientist, R&D Center, Biospectrum Life Science Institute
3Product Formulation R&D Manager, R&D Center, Biospectrum Life Science Institute
4Research Scientist, R&D Center, Biospectrum Fermentation Research Institute
5CEO, R&D Center, Biospectrum Life Science Institute
6R&D Manager, R&D Center, Biospectrum Life Science Institute
유지영1, 노경백2, 최송아2, 조은애3, 오세영4, 박덕훈5, 정은선6,
1바이오스펙트럼㈜ 생명과학연구소, 선임연구원
2바이오스펙트럼㈜ 생명과학연구소, 책임연구원
3바이오스펙트럼㈜ 생명과학연구소, 제품개발부 이사
4바이오스펙트럼㈜ 발효연구소, 주임연구원
5바이오스펙트럼㈜ 생명과학연구소, 대표이사
6바이오스펙트럼㈜ 생명과학연구소, 생명과학연구소장
*Corresponding author: Eun-Sun Jung Tel : +82-31-698-3123 E-mail : bioso@biospectrum.com
This work was supported by the Industrial Cluster Program funded by the Ministry of Trade, Industry and Energy (MOTIE, Korea) and the Korea Industrial Complex Corporation [Project Number: P0017747]
Received 2022 October 13; Revised 2022 December 13; Accepted 2023 January 19.

Trans Abstract

This study aims to investigate the anti-acne efficacy of the plant extract complex (PEC) consisting of Camellia sinensis L. leaf and Castanea crenata bur extract in vitro. The effect of PEC on anti-acne target including sebum production, Cutibacterium acnes (C. acnes)-induced inflammation, 5-alpha reductase activity and free radical scavenging activity was observed. The level of lipid production was measured through nile red staining in sebocytes to confirm the effectiveness of inhibiting sebum production, and C. acnes cultured medium (C. acnes CM) were treated on HEK293-hTLR2 cells to observe TLR2 activity. In addition, regulation of 5-alpha reductase activity was confirmed using rat liver microsomes, and antioxidant capacity was measured by DPPH assay. As a result, PEC showed the inhibitory effect on sebum production up to 59.02±5.13% at 100 μg/mL and the C. acnes CM with PEC treated group dramatically inhibited the TLR2 activity as much as the control level. At 100 μg/mL of the PEC, the activity of 5-alpha reductase enzyme activity was suppressed by about 20% compared to the group treated with rat microsomes, and the radical scavenging capacity was measured at 86.83±10.19. These results suggest that PEC, a complex extract of Camellia sinensis L. leaf and Castanea crenata bur, can be used as natural cosmetic raw materials that can relieve acne through inhibition of excessive sebum production, reduction of 5-alpha reductase activity, anti-inflammatory, and antioxidant properties.

I. 서 론

녹차로 이용되는 차나무(Camellia sinesis L.)는 동백나무 속의 상록 관목이다. 녹차는 방향족 알코올 화합물인 폴리페놀을 함유하고 있으며 대표적으로 카테킨, 플라보노이드, 플라보놀이 있다. 폴리페놀은 피지 생성을 억제할 수 있으며(Saric et al., 2016), C. acnes에 의해 활성화된 염증반응을 감소시키고, 항산화제로도 사용된다(Yoon et al., 2013; Forester & Lambert, 2011).

밤나무(Castanea crenata Siebold & Zucc, C. crenata)는 참나무과의 낙엽 활엽 교목으로써 한반도 전역에 분포한다. 밤나무의 다양한 부위로부터 얻어진 추출물은 항산화, 항균, 항알레르기, 지방 생성억제 등의 효과를 나타내며, 밤송이(C. crenata bur)는 총포라고 해서 밤 수확 후 버려지는 부산물로 동의보감에서는 단독(erysipelas)의 한약재로 사용되었다는 기록이 있다(Ahn et al., 2013; Kim et al., 2014; Youn et al., 2016). 또한 밤송이 추출물은 항산화, 항염, 티로시나아제 저해와 콜라제네이즈 저해 효과를 보인다는 결과가 있다(Lee et al., 2017).

피부는 신체의 가장 바깥쪽에 위치한 기관으로 질환이 발생하면 미적, 심리적 스트레스가 동반된다. 대표적 피부질환 중 하나인 여드름은 피지샘이 발달한 얼굴, 이마, 가슴, 어깨나 등 위쪽에 흔히 발생하는 만성 염증성 질환으로 10대에 남성 호르몬인 안드로젠 호르몬 분비가 왕성해지면서 피지선의 급격한 발달과 함께 코와 이마에 주로 발생하는 사춘기 여드름과 25세 이상에서 나타나는 성인 여드름으로 나누어진다(Williams et al., 2012). 성인 여드름의 요인으로는 스트레스 호르몬인 코르티솔, 화장, 면도, 식습관, 미세먼지 등이 알려져 있다(Cong et al., 2019). 지속적으로 증가하는 여드름 환자들에 대한 다양한 치료 방법들이 연구되어 왔으며, 대표적인 치료 기전으로 피지의 이상 분비 조절, 염증반응 억제, 여드름균으로 일컬어지는 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes, C. acnes)의 작용 저해, 호르몬 기전 조절, 과각질화 억제가 있다(Kurokawa et al., 2009).

피지를 분비하는 피지선은 모낭 협부와 연결되어 모낭과 함께 털피지샘단위로 정의되며 얼굴 쪽에 높은 밀도로 존재한다. 피지선의 바깥층은 peripheral zone으로 전피지세포가 증식을 시작하며 안쪽의 maturation zone으로 이동하면서 분화하여 지방 소립을 함유하게 된다. 최종적으로 가장 안쪽에 위치한 necrotic zone에서 피지 세포의 막과 핵이 분해되면서 피지를 분비하게 된다(Clayton et al., 2019). 피지분비의 정확한 기전은 아직 알려지지 않았으나 영향을 주는 요인으로 성호르몬인 안드로젠과 레티노이드, 지질 합성과 관련된 페르옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)나 스테롤 조절 요소 결합 단백질-1(sterol regulatory element-binding protein-1, SREBP-1)이 언급된다. 그 중에서도 안드로젠의 조절과 관련한 피지분비는 in vitro에서 논쟁이 있지만, 안드로젠인 테스토스테론과 5알파 환원 효소에 의해 전환되어 테스토스테론 보다 더 높은 활성을 보이는 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)이 피지 세포의 증식과 지질 합성을 유도할 것이라는 논문들과, 호르몬치료가 임상에서 효과를 보인다는 결과들을 바탕으로 안드로젠과 관련된 여드름 치료는 꾸준히 진행되고 있다(Barrault et al., 2015; Hazarika, 2021; Sanchez & Keri, 2022).

여드름의 주요 원인균으로 일컬어지는 C. acnes는 독성인자들을 분비하여 염증반응을 일으킨다. 크리스티-앳킨스-먼치-피터슨(Christie-Atkins-Munch-Peterson, CAMP)인자, 리파아제, 시알리다아제 등의 독성인자들은 Toll-유사 수용체2(Toll-like receptor 2, TLR2)에 작용하여 핵인자 카파비(Nuclear factor-κB, NF-κB)를 활성화시켜서 각질형성세포, 피지 세포, 그리고 면역세포로부터 전 염증성 사이토카인을 분비하게 하여 염증 반응을 일으키는데, 이러한 연속적인 작용들은 C. acnes의 집락 형성을 유도하며 최종적으로는 생체막을 형성하고 항생제 저항성을 나타내 여드름 치료에 어려움을 더하고 있다(Burkhart & Burkhart, 2003; Zhang et al., 2019).

호중구와 같은 식세포는 침입하는 미생물을 용해하기 위해 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하지만, 과도한 ROS의 생산은 주변 조직에 손상을 유발한다. 특히나 여드름의 염증 반응이 일어나는 곳에서는 C. acnes의 자극으로 식세포로부터의 ROS 생성이 더욱 증가하여 세포에 심한 손상을 일으키기 때문에 ROS의 생성을 억제하는 것이 여드름 치료에 중요하다(Akamatsu & Horio, 1998).

본 연구는 항 여드름 효능타겟 선행 스크리닝 시험에서 녹차와 밤송이 추출물을 선별하였으며, 이들 추출물을 동량 비율로 혼합한 식물복합추출물(plant extract complex, PEC)을 제조하였다. 이후 복합추출물의 여드름 완화 기능을 확인하기 위하여 피지 생성 억제능, 5 알파 환원효소 활성 억제능, 여드름균에 의한 염증 완화 효능 및 항산화 효능을 in vitro 수준에서 확인하였다.

II. 재료 및 방법

1. 사용 시료 및 복합추출물

피지 세포의 분화를 유도하기 위해 사용된 팔미트산과 피지 염색에 사용된 나일 레드는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 5 알파 환원효소 억제능 시험에 사용된 dithiothreitol는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서, NADPH는 Roche Holding AG(Basel, Switzerland)에서 구매하였으며, testosterone은 ChemFaces (Hubei, China)에서, potassium phosphate와 rat liver microsome은 Sigma-Aldrich에서 각각 구매하여 사용하였다. 세포생존성 측정을 위한 3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)와 DPPH assay에 사용된 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 아스코르브산은 Sigma-Aldrich에서 구매하여 사용하였다. 밤나무 총포는 풍천인삼약초영농조합(Chungcheongnam-do, Korea)에서 구입하였으며, 녹차 잎은 올티스 영농조합법인(Jeju, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 건조된 밤나무 총포에 물을 첨가한 후 90oC에서 3 h 동안 가열 추출하고, 건조된 녹차 잎에 물을 첨가한 후 80oC에서 3 h 동안 가열하여 추출한다. 각각의 추출물을 감압 농축기(Rotary evaporator N-1000, EYELA, Japan)를 사용하여 농축한 다음 분무 건조기(TF-S2L Mini Spray Dryer, Tefic Biotech Co., Limited, China)를 사용하여 각각 분말화하였다. 밤송이:녹차 비율을 1:1 동량 비율로 혼합한 시료를 효능평가에 사용하였다.

2. 피지 생성 측정

인간 피지 세포(Celprogen, Torrance, CA, USA)는 Sebocyte Complete Growth Media (Celprogen)에서 37oC, 5% CO2 조건으로 배양한 뒤 실험에 사용하였다. 100 μM 팔미트산을 처리하여 피지 생성을 유도하였으며, 팔미트산과 함께 복합추출물을 1, 10, 50, 100 μg/mL로 희석하여 처리한 뒤, 72 h 동안 배양하였다. 배양한 세포를 4% 포름알데하이드로 10분간 고정하고 10 μg/mL 나일 레드를 1:100으로 희석하여 15분간 염색하였다. 핵은 Hoechst 33342로 염색하였으며 형광현미경(EVOS®FL, Thermo Fisher Scientific)으로 측정하였다. 피지 생성 정도를 측정하기 위한 사진 분석은 ImageJ를 이용하였다.

3. C. acnes의 배양액 준비

C. acnes 균은 ATCC(American Type Culture Collection ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였으며, Reinforced Clostridial Medium(RCM, Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 37oC 혐기성 조건으로 48 h 배양한 뒤 사용하였다. C. acnes는 1 × 107 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)/mL로 조정하였으며 96웰 플레이트 각 웰 마다 1 × 105 CFU/mL로 세균 현탁액을 접종하고 500, 1000, 2000 μg/mL로 복합추출물을 처리한 조건(PEC-treated C. acnes cultured media; C. acnes 복합추출물)과 처리하지 않은 조건(C. acnes cultured media; C. acnes CM)으로 18 h 동안 배양하였다. 배양액은 모아서 0.22 마이크론 기공 크기의 필터(EMD Millipore, Temecula, CA, USA)로 여과한 후 사용하였다.

4. TLR2/NF-κB/SEAP 활성 측정

TLR2 활성을 측정하기 위하여 human TLR2/NF-κB/SEAP reporter HEK293 세포(HEK293-BlueTM hTLR2, InvivoGen, SanDiego, CA, USA)를 사용하였다. HEK293-hTLR2 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA) 에서 37oC, 5% CO2 조건으로 배양한 뒤 실험에 사용하였다. HEK293-hTLR2 세포에 C. acnes CM과 C. acnes 복합추출물을 1/100로 처리하여 6 h 동안 배양한 뒤, 배양액을 QUANTI-BlueTM 용액(InvivoGen)과 30분 동안 반응시켜 secreted alkaline phosphatase(SEAP) 활성을 620 nm 파장에서 측정하였다(Epoch, Bio-Tek Inc., Winooski, VT, USA).

5. 세포생존성 측정

HEK293-hTLR2의 세포생존성을 측정하기 위하여 HEK293-hTLR2 세포를 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco)이 포함된 DMEM에서 37oC, 5% CO2 조건으로 배양한 뒤 복합추출물을 1, 10, 50, 100 μg/mL로 처리하였다. 6 h 동안 배양한 뒤, 0.1 mg/mL MTT 용액(Sigma-Aldrich)을 1 h 동안 처리하고 DMSO에 formazan을 녹여 570 nm 파장에서 세포생존성을 측정하였다(Epoch, Bio-Tek Inc.).

6. 5 알파 환원효소 활성 측정

1mmol/L dithiothreitol, pH 6.5, 40 mmol/L potassium phosphate, 100 μmol/L NADPH와 3.5 μmol/L testosterone으로 반응용액을 제조하여 20분 동안 상온에 놓아두었다. 반응용액에 20 μg/mL 래트 간 마이크로좀(Rat liver microsome)과 피나스테라이드, 복합추출물을 첨가하고 37oC에서 1 h 동안 반응시켰다. 반응용액을 동결 건조한 후 메탄올에 녹여 0.2 마이크론 필터(Pall, NY, USA)로 여과하고 HPLC(Waters 2695 Separation Module, Waters 2996 Photodiode Array Detector, Waters, MA, USA)로 테스토스테론 양을 측정하였다. 이동상인 0.1% 트리플루오로 아세트산:아세토니트릴(50:50,v/v)의 유속을 1.0 mL/min 기반으로 분석하였다.

7. DPPH 라디칼 소거능 측정

복합추출물을 1 , 10, 50, 100 μ g /mL의 농도로 100% 메탄올에 희석하여 사용하였다. DPPH는 2 mM 농도로 제조한 뒤, 100% 메탄올에 희석하여 517 nm에서 흡광도를 0.5 기준으로 맞춘 후, 실험에 사용하였다. DPPH와 희석한 복합추출물을 1:1로 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 뒤, 517 nm에서 남아있는 DPPH의 양을 흡광도로 측정하였다(Epoch, Bio-Tek Inc.). 대조구로는 동량의 메탄올을 사용하였으며, 시료의 항산화능은 대조구와 비교하여 감소된 흡광도 값을 퍼센트로 계산하여 나타내었다.

Radical Scavenging Activity (%) = (1 - Absorbance of test material/Absorbance of control) × 100

8. 통계분석

모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며, 데이터는 평균±표준편차(S.D)로 표시하였다. 데이터는 student’s t-test로 검증되었으며 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

III. 결과 및 고찰

1. 피지 생성 억제 효능

과도한 피지 생성은 여드름의 주요 원인이자 결과로 과다하게 생성되는 피지를 감소시키는 것이 여드름 발생을 줄이거나 그 병변을 완화하는 것에 있어서 중요하다(Li et al., 2017). 따라서 피지 생성과 그 억제를 확인하기 위해 인간 피지 세포에 피지 생성 유도 물질인 팔미트산과, 녹차-밤송이의 복합추출물을 처리하여 피지 세포 내, 생성되는 피지 정도를 나일 레드 염색을 통해 확인하였다. 포화지방산인 팔미트산은 피부의 지질 함량 조절 및 염증 반응에 관여할 뿐 아니라, 피지 세포의 지질 함량과 중성지방 수치를 증가시킬 수 있다고 알려져 있다(Choi et al., 2019).

녹차-밤송이의 복합추출물의 피지 생성 억제능을 확인한 결과 Fig. 1과 같다. 피지 세포 내에서 팔미트산으로 유도된 피지 생성은 복합추출물 처리 시, 농도 의존적으로 감소하는 결과를 보였다. 팔미트산과 비교하였을 때, 복합추출물 처리 시 1 μg/mL에서 14.74±2.32%, 10 μg/mL에서 34.79±7.34%, 50 μg/mL 에서 51.25±6.46%, 100 μg/mL에서 59.02±5.13%의 피지 생성억제능을 보였다. 이는 녹차에 포함된 주요 폴리페놀인 Epigallocatechin-3-gallate(EGCG)와 대표적인 여드름 치료제인 isotretinoin(13-cis-RA)이 각각 100 μM과 1 μM에서 40% 정도의 피지 억제능을 보이고 경증 여드름 치료에 사용하는 adapalene이 10 nM에서 55% 정도의 피지 억제능을 보이는 것과 비슷한 수준으로 나타났다(Im et al., 2012; Sato et al., 2013).

Fig. 1.

Repression of sebum production by PEC in sebocytes. Sebocytes were cultured in various concentration (1-100 μg/mL) of PEC with 100 μM palmitic acid for 72 h. Sebum production levels were detected by nile red staining and measured using ImageJ. Scale bar is 100 μm. All results are shown as the mean ± standard deviation of triplicate data. *p < 0.05 compared to palmitic acid treated group.

2. 항염 효능

여드름은 만성 염증성 질환으로 여드름 치료를 위해 염증반응을 낮추는 방법들이 고려된다. 이러한 염증반응은 주로 C. acnes에 의해 유도되는데, 피부 세포나 면역 세포 내에서 염증반응 신호를 활성화시켜 염증성 사이토카인 분비를 촉진한다. C. acnes는 리파아제, 시알리다아제와 CAMP와 같은 다양한 독성 인자들을 분비하고, 이러한 인자들은 세포막에 위치한 TLR2와 반응하여 세포 내에서 NF-κB 신호를 활성화한다. 활성화된 신호는 IκB 키나아제(IκB kinase, IKK)를 인산화시키고 세포질에 존재하는 NF-κB로부터 IκB를 분리시켜 NF-κB가 핵내로 이동할 수 있게 해줌으로써, 염증성 사이토카인과 관련된 유전자의 발현을 유도한다(Kawasaki & Kawai, 2014). 이러한 기전을 바탕으로 인간 TLR2 유전자를 발현하는 SEAP reporter 293 세포(HEK293-hTLR2 세포)를 이용하여 항염 효능을 측정하였다.

실험을 위해 C. acnes를 녹차-밤송이의 복합추출물과 함께 배양한 뒤, 배양액을 모아 HEK293-hTLR2 세포에 처리하여 항염 효능을 확인한 결과 Fig . 2와 같다. 이는 C. acnes로부터 분비되는 독성물질을 PEC가 억제할 수 있는지 확인하기 위해 수행되었으며, 복합추출물인 PEC를 처리하지 않고 C. acnes만 배양한 배양액(C. acnes CM)과 C. acnes를 PEC와 함께 배양하여 얻은 배양액(PEC-treated C. acnes cultured media; C. acnes 복합추출물)으로 진행하였다. 녹차-밤송이 복합추출물의 단독 처리 시, 100 μg/mL까지 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(Fig. 2A). 또한 C. acnes CM과 C. acnes 복합추출물 역시, 수행한 실험 농도 내에서 세포 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 2B). 복합추출물을 처리하지 않고 C. acnes만 배양한 배양액을 처리한 것에 비해 복합추출물과 함께 배양한 배양액을 처리한 실험군에서는 TLR2 활성이 우수하게 억제되었음을 확인하였다(Fig. 2C). 이는 선행연구에서 진행된 C. acnes에 대한 항균 효과 실험과 C. acnes균을 처리하여 항염 효과를 확인한 실험과는 달리, C. acnes의 직접적인 작용이 아니더라도 C. acnes로 부터 분비되는 독성물질이 TLR2를 활성화할 수 있고, 녹차-밤송이의 복합추출물이 C. acnes로부터 분비되는 독성물질의 수준을 낮춤으로써 염증반응을 억제할 수 있을 것이라는 결과를 보여준다.

Fig. 2.

Inhibition of TLR2 activity by PEC-treated C. acnes cultured media. HEK293-hTLR2 cells were treated with C. acnes cultured media or PEC-treated C. acnes cultured media for 6 h. (A) Cell viability of PEC-only treatment group was measured using MTT assay 6 h after treatment of PEC with cells. (B) Cell viability of C. acnes cultured media and PEC-treated C. acnes cultured media was measured using MTT assay 6 h after each cultured media was diluted to 1/100 and treated with cells. (C) TLR2 activity was measured by SEAP activity after 6 h of treating the cells with C. acnes cultured media and PEC-treated C. acnes cultured media in 1/100, respectively. C. acnes cultured media is a culture solution obtained by culturing only C. acnes without treating PEC, a complex extract, and PEC-treated C. acnes cultured media means a culture solution obtained by culturing C. acnes with PEC. All results are shown as the mean ± standard deviation of triplicate data. *p < 0.05 compared to C. acnes cultured medium treated group.

3. 5 알파 환원효소 활성 억제 효능

안드로젠에 의한 피지 생성은 테스토스테론을 DHT로 전환하는 5 알파 환원효소 활성과 관련이 있다. DHT는 테스토스테론보다 안드로젠 수용체에 대한 친화도가 더 높아서 결합이 안정적이고 그 효과가 더 높다(Makrantonaki et al., 2011). 따라서 5 알파 환원효소의 활성을 저해하여 DHT의 생성을 감소시키면, 안드로겐 신호를 저해함으로써 과도한 피지 생성을 억제할 수 있다(Lai et al., 2012). 이를 기반으로 5 알파 환원효소 활성억제 효능을 측정하기 위해 5 알파 환원효소를 포함하는 래트간 마이크로좀을 이용하여 복합추출물의 5 알파 환원효소 활성억제 효능을 측정하였다.

복합추출물을 테스토스테론, 래트 마이크로좀과 농도 별로 반응시킨 후, 남아 있는 테스토스테론의 상대적인 양으로 5 알파 환원효소의 활성을 확인한 결과 Fig. 3과 같이 나타났다. 피나스테라이드는 양성대조군으로 사용되었다. 복합추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 복합추출물을 처리한 실험군의 상대적인 테스토스테론 양이 1 μg/mL에서 54.04±0.47%, 10 μg/mL에서 60.53±1.05%, 50 μg/mL에서 63.82±0.32%, 100 μg/mL에서 73.84±1.29%로 측정되었다. 이 결과는 래트 간 마이크로좀 내 5 알파 환원효소 활성이 복합추출물에 의해 억제되어 테스토스테론이 DHT로 전환되지 않고 남아있음을 시사한다. 또한 양성대조군으로 쓰인 5 알파 환원효소 억제제인 피나스테라이드 25 μg /mL에서 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 72%의 테스토스테론이 존재하는 것으로 나타나 녹차-밤송이 복합추출물 100 μg/mL과 유사한 5알파 환원 효소 활성 억제능을 갖는 것으로 나타났다. 이는 5 알파 환원효소의 활성을 간접적으로 확인한 결과로, 복합추출물이 5 알파 환원 효소에 직접적으로 결합하여 효소활성을 억제하였는지는 알 수 없다. 하지만, 효소 반응에 있어 복합추출물을 처리하였을 때, 5 알파 환원효소와 반응하는 테스토스테론의 양이 감소하지 않고 남아있는 것으로 보아 복합추출물이 5 알파 환원효소의 작용에 직접 또는 간접적으로 영향을 주었다고 볼 수 있다.

Fig. 3.

Reduction of 5 alpha reductase activity by PEC. The mixture containing testosterone and rat liver microsome was reacted with PEC or finasteride for 1 h. 5 alpha reductase activity was measured by detecting the remaining amount of testosterone with HPLC. All results are shown as the mean ± standard deviation of triplicate data. *p < 0.05 compared to microsome treated group.

최근 연구에서는, 참나무과에 속하는 상수리나무(Quercus acutissima)의 껍질 추출물이 5 알파 환원효소 활성 억제능을 나타내는 것으로 보고되었다(Koseki et al., 2015). 또한 하수오(Polygonum multiflorum Thunb.) 추출물과 그로부터 유래한 활성 성분이 5 알파 환원효소를 억제한다는 연구 결과도 보고되었다(Cho et al., 2010). 대부분의 천연물 연구의 경우, 5 알파 환원효소 활성 억제에 초점을 맞추고 연구가 진행되었으며, 실제로 세포 내에서 이들의 작용에 대한 연구까지는 진행이 이루어지지 않고 있다. 본 연구에서는 녹차-밤송이 복합추출물이 5 알파 환원효소의 활성을 억제하여 DHT 생성을 억제하는 결과를 확인하였고, 이 작용이 실제 피지 세포에서의 피지 생성에 있어서도 효과적으로 작용한다는 결과를 보여주었다. 이 같은 결과는, 이어지는 임상 연구 등을 통해 실제 피부에서의 효능이 확인된다면 여드름 치료에 있어 새로운 천연물 소재로서의 가능성을 보여줄 것으로 판단된다.

4. 항산화 효능

산화 스트레스는 여드름 진행에 영향을 미치고 병변 활동을 평가하는데 지표로도 사용된다(Al-Shobaili, 2014). ROS는 유전자 변형과 지질의 과산화, 염증성 사이토카인의 분비를 유도한다(Briganti & Picardo, 2003). 이러한 일련의 작용들은 여드름 병변을 악화시키는 기전으로 작용하므로, ROS를 제거함으로써 여드름을 완화할 수 있다. DPPH는 항산화능을 측정하는 방법으로 라디칼 소거를 통해 ROS 제거능을 확인하는 실험이며, 이를 바탕으로 항산화 실험을 실시하였다.

복합추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과 Fig . 4와 같으며, 아스코르브산은 양성대조군으로 사용되었다. 복합추출물 처리 시 1 μ g /mL에서 29.23±0.26%, 10 μg/mL에서 86.10±0.14%, 50 μg/mL에서 86.90±1.00%, 100 μg/mL에서 86.83±10.19%의 높은 항산화능이 측정되었다. 양성대조군인 아스코르브산과 비교했을 때도 복합추출물 10 μg/mL 이상의 처리조건에서 거의 유사한 항산화능이 관찰되었다. 이는 이은경(2018)의 녹차를 포함한 천연 복합혼합물이 500 μg/mL에서 3 μg/mL의 아스코르브산과 비슷한 항산화 효능을 보인 것과 비교해 볼 때, 녹차-밤송이의 복합추출물은 더 낮은 농도인 10 μg/mL에서 10 μg/mL의 아스코르브산과 비슷한 항산화 효능을 갖는 것으로 나타났다(Lee & Jung, 2018).

IV. 결 론

본 연구는 천연물인 녹차와 밤나무총포를 포함하는 복합추출물의 항 여드름 효능을 확인하기 위해 여드름의 주요한 치료 기전들인 과다한 피지분비 억제, 항염, 5 알파 환원효소 활성 억제와 항산화능을 측정하였다. 피지 세포에 복합추출물 처리 시 팔미트산으로 유도되는 피지 생성을 농도 의존적으로 감소시켰으며 50 μg/mL 처리 조건에서 50% 이상 억제하는 것을 확인하였다. 복합추출물은 TLR2의 활성을 C. acnes CM을 처리하지 않은 상태와 비슷한 수준으로까지 억제하였으며, 이는 복합추출물이 C. acnes의 독성인자 분비를 감소시킴으로써 염증 반응을 억제하였다고 볼 수 있다. 또한 복합추출물이 5 알파 환원효소의 활성을 억제하여 테스토스테론이 DHT로 전환되는 반응을 60%까지 억제할 수 있으며, 10 μg/mL의 낮은 농도에서 80% 이상의 높은 라디칼 소거능도 있다는 것을 확인하였다. 이를 종합해 볼 때, 녹차와 밤송이로 구성된 복합추출물은 천연물로써 과도하게 분비되는 피지의 억제, C. acnes에 의해 일어나는 염증반응의 억제, DHT 합성에 관여하는 5 알파 환원효소 활성 억제와 지질의 산화나 피부 손상을 가져오는 자유라디칼의 생성억제를 통해 결과적으로 여드름 피부 개선을 위한 소재로 사용할 수 있을 것이라 사료된다.

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Fig. 1.

Repression of sebum production by PEC in sebocytes. Sebocytes were cultured in various concentration (1-100 μg/mL) of PEC with 100 μM palmitic acid for 72 h. Sebum production levels were detected by nile red staining and measured using ImageJ. Scale bar is 100 μm. All results are shown as the mean ± standard deviation of triplicate data. *p < 0.05 compared to palmitic acid treated group.

Fig. 2.

Inhibition of TLR2 activity by PEC-treated C. acnes cultured media. HEK293-hTLR2 cells were treated with C. acnes cultured media or PEC-treated C. acnes cultured media for 6 h. (A) Cell viability of PEC-only treatment group was measured using MTT assay 6 h after treatment of PEC with cells. (B) Cell viability of C. acnes cultured media and PEC-treated C. acnes cultured media was measured using MTT assay 6 h after each cultured media was diluted to 1/100 and treated with cells. (C) TLR2 activity was measured by SEAP activity after 6 h of treating the cells with C. acnes cultured media and PEC-treated C. acnes cultured media in 1/100, respectively. C. acnes cultured media is a culture solution obtained by culturing only C. acnes without treating PEC, a complex extract, and PEC-treated C. acnes cultured media means a culture solution obtained by culturing C. acnes with PEC. All results are shown as the mean ± standard deviation of triplicate data. *p < 0.05 compared to C. acnes cultured medium treated group.

Fig. 3.

Reduction of 5 alpha reductase activity by PEC. The mixture containing testosterone and rat liver microsome was reacted with PEC or finasteride for 1 h. 5 alpha reductase activity was measured by detecting the remaining amount of testosterone with HPLC. All results are shown as the mean ± standard deviation of triplicate data. *p < 0.05 compared to microsome treated group.