*Corresponding author: Jong-Du Kim Tel : +82-2-3668-9864 E-mail :I. 서 론
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포 내 호흡, 세포질 내 효소 작용 등에 의해 내인성으로 형성되거나 다양한 외부 요인에 의해 생성되어 지며, 세포 신호와 항상성에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Papa and Skulachev, 1997). 이들은 생체 내 항산화 작용으로 제거됨으로써 생성과 제거 간의 균형을 유지하게 되나 생성된 과량의 활성산소가 완전하게 제거되지 못할 경우 생체 내 활성산소의 불균형 상태인 산화스트레스를 초래하게 된다(Borrello et al., 1984; Gordon, 1996; Aruoma, 1991; Rhee, 2006; Ozben, 2007). 이와 같이 산화적 스트레스는 콜라겐, 엘라스틴 및 히아루론산 사슬 절단, 멜라닌 생성 촉진 등과 같이 피부세포 또는 피부 조직 구성 성분들의 손상을 야기하며, 피부 염증 유발 및 피부면역기능 억제를 통한 세균 감염증 또는 발암율의 증가를 가져와 피부 노화를 가속화 시키는 것으로 보고되고 있다(Rinnerthaler et al., 2015; Masaki, 2010). 이외에도 활성산소종은 체내 지질, 단백질, DNA 등을 손상시키는 원인이 되며 세포 기능 억제 등 생명체에 유해한 물질로 작용하여 인체에 다양한 질병을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Cencioni et al., 2013; Mahakunakorn et al., 2004; Kalyanaraman, 2013). 또한 산화스트레스는 단백질 또는 염증 관련 사이토카인의 발현을 증가시켜 혈관 및 조직에 염증 반응을 유발하는 주요한 원인으로 작용하는 것으로 보고되고 있다(Kim and Son, 2011). 염증이란 외부로부터 들어온 항원(바이러스 등)에 대하여 염증 매개 물질들을 분비하는 등 생체 내 세포 및 조직 손상을 제거하기 위한 반응으로 주로 대식세포가 관여하며, 이들 대식세포는 lipopolysaccharides(LPS) 등에 의해 활성화되어 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2) 등 염증 매개물질들이 분비되며, 이 중 NO는 세포독성, 혈관이완, 세포 내 염증 반응 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Ashley et al., 2012; Coleman, 2001). 이와 같이 체내에서 활성산소를 조절하거나 활성산소에 의해 유도되는 염증 매개인자를 억제하는 기능성 소재를 천연물로부터 개발하기 위한 연구에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다.
지칭개(Hemistepta lyrata Bunge)는 중부 이남의 밭이나 들에 흔하게 자라는 국화과(Compositae)에 속하는 2년생 초본으로 우리나라 전국의 산이나 들에서 자생하며, 이외에도 중국, 일본, 동남아시아 및 오스트레일리아 등지에 분포한다. 지칭개는 이호채, 나미채 라는 생약명으로 불리며, 간기능 개선, 암, 염증·외상출혈, 치질, 발열을 내리는 약제로 민간에서 사용되어 왔다(Ha et al., 2002). 또한, 어린잎 및 새순은 나물로 섭취하기도 한다. 주요성분으로는 lignans, flavonoids, sesquiterpene lactones 등이 보고되고 있으며(Dong et al., 2010; Ha et al., 2002 & 2001; Zou et al., 2006), sesquiterpene lactones 화합물에 대한 간염, 간암 및 간섬유화에 대한 효능 연구가 보고되고 있다(Ha et al., 2003; Lee et al., 2013; Kim et al., 2020).
따라서 본 연구에서는 지칭개 100% 메탄올 추출물 및 그 용매분획물에 대하여 다양한 항산화 활성 및 마우스 macropahge 세포를 이용한 항염증 효능을 검증하여, 지칭개 추출물이 활성산소 조절 및 활성산소에 의해 유도되는 염증 매개인자를 억제하는 기능성 소재로 활용 가능한지 알아보기 위한 실험을 진행하였다.
II. 내용 및 방법
1. 시약 및 기기
Sodium carbonate, Folin & Ciocalteu’s phenol 시약, gallic acid, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS), Vitamin C, Cordycpein, K2S2O8은 Sigma-Aldrich Co., LLC(St. Louis, MO, U.S.A.) 제품을 사용하였다. Ethanol은 Duksan Pure Chemicals(Ansan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. HPLC grade methanol, HPLC grade water, HPLC grade acetonitrile은 Avantor(Radnor, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. 0.2 m PVDF filter는 GVS(Bologna, Italy)에서 구입하여 사용하였다.
2. 시료의 제조
본 실험에서 사용된 지칭개는 충북 오창에서 직접 채집하여 건조 후 실험에 사용하였다. 건조된 지칭개는 10 배량의 100% 메탄올 첨가한 후 상온에서 7일 동안 추출하였다. 추출액은 다시 여과지(Whatman NO. 2)로 여과하여 35°C에서 감압 농축한 다음 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 용매분획하여 실험에 사용하였다.
3. 성분 분석
지칭개 추출물 및 용매분획물의 성분을 분석하기 위해 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 각각의 추출물의 농도를 10 mg/ml로 조제한 다음 0.45 μm syringe filter로 여과한 시료를 20 μL 주입하여 1 mL/min의 유속으로 실온에서 20% 아세토나이트릴에서 100% 아세토나이트릴의 조건으로 254 nm에서 분석하였다.
4. 총 폴리페놀 함량 측정
시료의 총 폴리페놀 화합물 함량은 페놀성 물질인 Phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis 방법(Folin and Denis, 1912)을 이용하여 측정하였다. 10 g/mL의 농도로 Methanol에 용해시킨 시료액 0.2 mL와 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.) 0.2 mL를 첨가하여 혼합 시킨 후, 3분간 실온에서 반응시킨 뒤 20% sodium carbonate(Na2CO3, Sigma-Aldrich Co.) 150 μL를 가하여 암실에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상등액을 ELISA reader(Microplate Absorbance Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, U.S.A)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후, 이 검량곡선으로부터 시료의 총 폴리페놀 화합물 함량을 구하였다.
5. 항산화활성
1) DPPH radical 소거능
항산화 활성은 DPPH를 이용하여 시료의 radical 소거효과를 측정하는 Blois 방법(Blois, 1958)을 활용하여 측정하였다. 각 시료를 농도별로 제조하여 제조한 시료 10 μL와 0.15 mM DPPH (Sigma-Aldirich Co.)용액 190 μL를 넣어 교반한 뒤 암실에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 기존의 항산화제로 잘 알려져 있는 ascorbic acid를 대조구로 사용하여 값을 비교하였다.
2) ABTS radical 소거능
ABTS(2,2’-Azinobis(3-ethylenbenzothizoline-6-sulfonate) radical 소거능의 측정은 Pellegrini 등의 방법(Pellegrini et al., 1999)에 의해 측정하였다. 7 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.) 10 mL와 140 mM K2S2O8 (Sigma-Aldrich Co.) 176 μL를 혼합하여 어두운 곳에서 14시간 이상 반응시킨 후 이를 에탄올과 1:88 비율로 혼합하여 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 200 μL ABTS solution를 취하여 각 농도별 시료 10 μL를 혼합하여 암실에서 2분 30초간 방치한 후 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 항산화제로 잘 알려져 있는 ascorbic acid의 항산화 능을 측정한 값과 비교하였다.
3) FRAP 활성
Benzie와 Strain의 방법에 준하여 측정하였다(Benzie and Strain, 1996). FRAP reagent는 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.5)와 20 mM FeCl3·6H2O, 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-striazine(TPTZ) (Sigma-Aldrich Co.)를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 사용하였다. 제조한 FRAP reagent 300 μL와 농도별로 희석한 시료 30 μL를 혼합하여 37°C에서 10분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP value는 표준물질인 iron sulfate hexahydrate (FeSO4·7H2O)을 사용하여 측정한 표준검량곡선에 대입하여 얻었다.
6. 세포 배양, 세포독성 및 Nitric oxide(NO) 생성량 측정 평가
마우스 대식세포인 J774 cell line을 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입한 후 실험에 사용하였다. 1% penicillin-streptomycin(Gibco, Grand Island, NY., USA)와 10% fetal bovine serum(Hyclone, Victroia, Australia)을 포함하는 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM, Gibco) 배지를 사용하여 5%, CO2를 함유한 37°C incubator(BB 15, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에서 배양하였다. NO 생성량 측정 및 세포독성 측정을 위해 J774 세포는 2×105 cells/mL 농도로 희석하여 96 well plate에 200 μL씩 분주하고 24시간 동안 배양하였으며, 추출물 및 분획물(12.5, 25, 50 μg/mL)을 1시간 전처리 한 후 1 μg/mL 농도의 LPS(Sigma-Aldrich Co.)를 처리하고 24시간 배양하였다. 96 well plate로부터 NO 생성량 측정을 위해 100 μL의 세포배양액을 취하였으며, 100 μL의 세포배양액에 100 μL의 Griess reagent(Promega, Madison, WI, USA)과 혼합하여 10분간 암반응시킨 후 550 nm에서 흡광도(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 측정하였다. 세포로부터 생성된 NO의 함량은 sodium nitrite(NaNO2)를 사용하여 작성한 표준검량곡선에 대입하여 산출하였다. 남아 있는 100 μL의 세포배양액에는 EZ-Cytox WST assay reagent(Daeil lab service Co. Ltd., Seoul, Korea) 10 μL를 첨가하고 3시간 후에 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Raw 264.7 세포의 생존율은 추출물 처리를 하지 않은 대조군 세포의 생존율 대비 상대세포생존율(%)을 계산하여 나타내었다.
III. 결과 및 고찰
1. 지칭개 추출물 및 용매별 분획물의 총폴리페놀 함량 분석
폴리페놀 화합물은 항산화, 항염, 항균 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있으며, 식물계의 2차 대사산물로 다양한 구조와 분자량을 가지는 것으로 알려져 있다(Manach et al., 2005; Kang et al., 2017). 지칭개는 100% 메탄올로 추출하였으며, 헥산(hexane), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(BuOH)로 용매 분획하였다. 지칭개 추출물 및 각각의 분획물은 1, 5, 10 mg/mL 농도로 조제 후 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 지칭개 100% 메탄올 추출물은 각각의 농도에서 53.7, 63.2, 139.5 GAE mg/mL로 측정되었으며, 헥산 분힉물은 각각의 농도에서 4.5, 10.3, 23.9 GAE mg/mL로 측정되었다. 에틸아세테이트 분획물의 총 폴리페놀 함량은 1, 5, 10 mg/mL 농도에서 218.9, 227.2, 226.7 GAE mg/mL로 가장 높게 측정되었으며, 그다음으로 부탄올 분획물은 각각의 농도에서 118.5, 185.5, 239.95 GAE mg/mL로 측정되어 에틸아세테이트 분획물 다음으로 높게 측정되었다. 이상의 결과 에틸아세테이트 분획물은 각각의 농도에서 총 폴리페놀 함량이 헥산 분획물과 비교하여 각각 약 49배, 22배 및 9배 증가하는 것으로 측정되었으며, 또한 부탄올 분획물의 총폴리페놀 함량도 헥산 분획물과 비교하여 26, 18, 10배 높게 측정되었다. 이상의 결과 지칭개 메탄올 추출물의 폴리페놀 성분들은 용매 분획 시 에틸아세테이트 및 부탄올로 이행됨을 확인할 수 있었다. 총 폴리페놀 화합물의 함량이 증가하면서 항산화 활성도 증가한다는 연구 결과가 보고되고 있어(Choi et al., 2015), 지칭개 메탄올 추출물과 용매 분획물들의 폴리페놀 성분 함량과 생리활성과의 상관관계를 확인하기 위하여 다양한 항산화활성을 측정하였다. 지칭개 추출물 및 용매 분획물에 대한 총 폴리페놀 함량은 Table 1에 정리하였다.
2. 지칭개 추출물 및 용매별 분획물의 항산화 활성
1) DPPH radical 소거능
지칭개 추출물 및 용매 분획물에 대하여 DPPH 항산화 활성을 측정한 결과(Table 2), 메탄올 추출물은 1, 5, 10 mg/mL 농도에서 81%, 82% 및 85%의 DPPH 항산화 활성이 측정되었다. Table 1에서 보듯이 지칭개 메탄올 추출물에 대한 용매분획 후 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 헥산 분획물, 부탄올 분획물 그리고 에틸아세테이트 분획물 순으로 총 폴리페놀 함량이 높은 것으로 나타났으며, 폴리페놀 함량이 DPPH 항산화 활성에도 영향을 주는지 확인하였다. 실험결과, 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 부탄올 분획물 10 mg/mL 농도에서는 98%의 높은 DPPH 항산화 활성을 나타냈으며, 1 및 5 mg/mL 농도에서는 각각 82 및 83%의 DPPH 항산화 할성을 나타냈다. 낮은 농도에서도 총 폴리페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세테이트 분획물의 경우 56-80%의 DPPH 항산화 활성을 나타냈으며, 마지막으로 헥산 분획물의 경우 48-62%의 가장 낮은 DPPH 항산화활성을 나타내었다. 본 실험은 대조구로 vitamin C를 사용하였으며, 대조구의 경우 처리농도 1 mg/mL에서 96.55%로 높은 DPPH 항산화 활성을 보였다. 이상의 결과(Table 2)에서 살펴보듯이, 100% 메탄올 추출물에서 DPPH 항산화 활성을 나타내는 성분들이 부탄올 분획으로 이행된 것을 확인할 수 있었다. 부탄올 분획물의 총폴리페놀 함량은 10 mg/mL 농도에서만 에틸아세테이트 분획물과 비교하여 높게 측정되었으나, DPPH 실험결과는 부탄올 분획물이 에틸아세테이트 분획물보다 우수한 것으로 측정되었다. 보통 DDPH radical 소거능은 폴리페놀성 화합물의 함량과 매우 높은 상관성이 있는 것으로 보고(Choi et al., 2015)되고 있으나, 지칭개 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물의 시혐결과는 기존의 보고들과는 다른 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
2) ABTS radical 활성
각각의 추출물 및 용매 분획물은 1, 5 및 10 mg/mL 농도에서 ABTS radical 소거능을 통해 항산화 활성을 분석하였다(Table 3). 100% 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 ABTS radical 소거능을 나타내었으며, 그 소거능은 각각의 농도에서 91.42%, 91.98% 및 93.86%로 측정되었다. 각각의 용매 분획중 가장 높은 활성을 보인 에틸아세테이트 분획물의 ABTS radical 소거능은 97.94%, 97.89% 및 98.03%로 나타났으며, 그 다음으로 부탄올 분획물은 각각의 농도에서 92.92%, 93.53%, 94.80%의 ABTS radical 소거능을 나타내었다. 헥산 분획물은 처리된 농도에서 44.40-67.65%의 ABTS radical 소거능을 보였다. ABTS radiclal 소거능이 가장 높은 에틸아세테이트 분획물의 경우 DPPH radical 소거능과 비교하여 낮은 농도인 1 mg/mL에서는 약 40% 정도 높은 ABTS radical 소거능을 보였으며, 5 및 10 mg/mL 농도에서 약 21% 및 18% 정도 높은 소거능을 나타내었다. 또한, 부탄올 분획물의 경우 처리된 농도에서 약 5-10% 높은 ABTS radical 소거능을 보였으며, 헥산 분획물은 DPPH radical 활성과 유사한 ABTS radicla 소거능을 나타내었다. 이와 같이 각각의 추출물은 DPPH radical 소거능과 비교해보면 전체적으로 높은 ABTS radical 소거능을 보였다(Table 2 and Table 3). 또한, DPPH 실험과 다르게 지칭개 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물의 ABTS 실험에서는 폴리페놀 함량이 높은 에틸아세테이트 분획이 조금 더 우수한 시험결과를 나타내었다.
3) FRAP 활성
지칭개 메탄올 추출물 및 분획물을 1, 5 및 10 mg/mL 농도에서 FRAP assay에 의한 항산화 활성을 측정하였다(Fig. 1). 100% 에탄올 추출물은 각각의 농도에서 0.697, 0.755, 1.393의 흡광도 값이 측정되었으며, 에틸아세테이트 분획물은 1 및 5 mg/mL 농도에서 2.045 및 3.212의 흡광도 값이 측정되어 다른 분획물과 비교하여 가장 높은 항산화 활성을 나타냈다. 부탄올 분획물은 1, 5, 10 mg/mL 농도에서 1.846, 1.583, 2.815의 흡광도 값이 측정되어 에틸아세테이트 분획물 다음으로 높은 항산화 활성을 나타냈으며, 헥산 분획물이 0.393, 0.581, 1.014의 흡광도 값이 측정되어 다른 분획물과 비교하여 가장 낮은 측정값을 나타냈다. Table 1에서 보듯이 지칭개 메탄올 추출물에 대한 용매분획 후 총 폴리페놀 함량은 에틸아세테이트 분획물이 가장 높게 측정되었으며, ABTS radical 항산화 활성 결과에서도 보듯이 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 항산화 활성을 나타냈다. 이와 같이 FRAP assay에 의한 항산화 활성도 또한 ABTS 항산화 활성과 유사하게 용매 분획에 의해 추출되는 폴리페놀 성분의 함량 차이에 의해 영향을 받는 것으로 생각된다.
3. 지칭개 추출물 및 용매별 분획물의 항염활성
지칭개 추출물 및 용매 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위해 LPS로 자극한 J774 세포의 NO 생성량을 감소시킬 수 있는지 확인하였으며, 결과는 Fig. 2에 나타내었다. LPS만 단독으로 처리한 control군에서 생성된 NO농도는 16.89 μM 농도로 LPS를 처리하지 않은 negative control 5.96 μM에 비해 약 3배 높아 LPS에 의해 NO 생성이 충분히 유도되었음을 확인하였다. 100% 메탄올 추출물은 12.5, 25, 50 μg/mL 농도 처리시 NO 농도는 15.52, 14.22, 12.41 μM로 측정되었으며, 50 μg/mL 농도에서 41%의 저해율을 보였다. 각 분획물에 NO 생성 저해능을 측정해본 결과, 에틸아세테이트 분획물은 12.5, 25, 50 μg/mL 농도 처리시 NO 농도는 6.30, 5.89, 5.85 μM로 측정되었으며, 90-100% 의 높은 저해율을 나타냈다. 다음으로 헥산 분획물은 같은 농도 처리시 각각 12.63, 8.81, 8.44 μM의 NO 농도가 측정되었으며, 39-77%의 저해율을 나타냈다. 부탄올 분획물은 25-50%의 NO 생성 저해율을 나타내 가장 낮은 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같이 지칭개 100% 메탄올 추출물의 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 대조군으로 사용된 Dexamethasone과 비교하여 NO 생산량 억제 효과가 더 높게 측정되었으며, 염증 억제 개선효능이 있음을 확인하였다. Kim et. al.(2020)의 연구결과에 따르면 지칭개를 다양한 용매(열수, 에탄올, 메탄올, 클로로포름)로 추출하고 항염활성을 측정하였을 때 비극성 용매인 클로로포름 추출물이 다른 용매 추출물과 비교하여 우수한 항염활성을 나타내는 것을 보고하였다. 이와 유사하게 클로로포름과 유사한 극성을 가지는 에틸아세테이트로 사용한 지칭개 용매 분획물에서 우수한 항염활성을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 이것은 지칭개의 비극성 성분들이 주로 항염활성을 갖는 것으로 사료된다. J774 세포를 이용한 세포독성 실험결과 에틸아세테이트 분획물 50 μg/mL에서만 독성을 확인할 수 있었다.
4. 지칭개 추출물 및 용매별 분획물의 HPLC 분석
지칭개 100% MeOH 추출물 및 각 용매 분획물에 대한 성분을 분석하기 위해 HPLC 크로마토그램을 실시하였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 100% MeOH 추출물의 경우 HPLC 크로마토그램에서 5-20분대에 극성성분들이 주로 검출되었으며, 용매 분획물 중 항산화 및 항염증 활성이 가장 높은 에틸아세테이트 분획물은 13분, 14분, 18분, 20분 및 27분대 피크가 주피크로 분석되었다. 또한, 부탄올 분획물은 6분, 17분 및 19분대 피크가 주피크로 분석되었으며, 헥산 분획물은 비극성 성분들이 주로 검출되는 50-60분대 피크들이 검출되었다. 지칭개 추출물 중 항산화 및 항염증 활성을 나타내는 성분들은 주로 10-30분대 피크들로 생각되며, 이 성분들은 지칭개 주성분으로 알려진 lignans, flavonoids, sesquiterpene lactones(Dong et al., 2010; Ha et al., 2002 & 2001; Zou et al., 2006) 등의 성분 중 하나로 사료되어진다. 따라서, 항산화 및 항염활성을 나타내는 활성성분들의 구조를 확인하는 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 사료된다.
IV. 결 론
본 연구는 지칭개를 이용하여 기능성 소재의 가능성을 확인하고자 항염증 및 항산화에 대해 조사하였다. 지칭개는 100% 메탄올로 추출한 후, 용매 분획을 하였으며(헥산, 에틸아세테이트, 부탄올), 각각의 용매 분획물에 대한 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 에탄올 추출물의 폴리페놀 성분들이 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물로 용매가 이행됨을 확인하였다. 항산화 효능인 ABTS와 DPPH free radical 소거활성 및 FRAP assay을 통한 항산화 효능을 측정한 결과, 에틸아세테이트 및 부탄올 추출물이 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 총 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 효능이 높아짐을 확인하였다. 또한, 추출물 및 용매 분획물들에 대하여 J774 세포주를 이용해 염증 완화 효능을 검증한 결과, LPS를 처리한 세포에서 NO 수치가 증가하였으며, 추출물 및 용매 분획물을 농도별로 처리시 그 수치가 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 총 폴리페놀 함량이 높은 지칭개 에틸아세테이트 분획물에서 항염 및 항산화 활성을 매우 높게 나타내며 다른 분획물과 비교하여 활성을 나타내는 물질을 다수 포함하고 있을 것으로 생각되며 추가적인 활성 물질에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한, 총 폴리페놀 함량이 높은 소재는 우수한 항산화, 항노화, 항염증 등의 생리활성 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있어, 지칭개 추출물 및 분획물이 항산화 활성소재로서 활용이 가능할 것으로 판단되며, 결론적으로 지칭개 에틸아세테이트 분획물은 향후 피부질환에 관련된 기능성 소재로써 사용될 가능성이 사료된다.
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