황금 추출물 및 분획물의 지표성분 함량에 따른 항산화 및 항염증 효능 연구
Study on the Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects of Scutellaria baicalensis Extract and Fractions Based on Indicator Compound Content
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Trans Abstract
The skin, as a barrier against environmental stressors, is highly affected by rapid industrialization and pollution, leading to oxidative stress, aging, and inflammation. Growing interest in natural antioxidants, especially in functional cosmetics, has highlighted the need for safe, effective alternatives to synthetic ingredients. Scutellaria baicalensis is traditionally known for its antioxidant and anti-inflammatory properties, but research on its specific fractions remains limited. This study explores both the overall and fraction-specific efficacy of Scutellaria baicalensis extract for potential use in skincare. This study summarizes the evaluation of various biological activities of Scutellaria baicalensis extract and its fractions. In the first stage, DPPH and ABTS radical scavenging activities were investigated, identifying fractions with higher scavenging activity than the extract itself. In the second stage, cell viability was tested to determine concentrations that do not induce cytotoxicity. In RAW 264.7 macrophages, inflammation was induced using LPS, and the suppression of Nitrite production demonstrated the anti-inflammatory effects. In HaCaT cells, skin inflammation was induced with TNF-α and IFN-γ, and the reduction in interleukin (IL)-6 production was observed. Additionally, specific fractions exhibited a significant ability to regulate key chemokines like IL-8, RANTES, and TARC. The study also showed that the inhibition of ICAM-1 expression helped control cellular adhesion in the early stages of inflammation. Moreover, HPLC analysis confirmed that specific fractions contained higher concentrations of active ingredients compared to the extract, reinforcing their potential as natural cosmetic ingredients. Scutellaria baicalensis fractions showed exceptional antioxidant and anti-inflammatory effects, even in small amounts, indicating their potential use in functional cosmetics and anti-aging products. Future studies are expected to explore the development of natural cosmetic ingredients from these fractions, contributing to the growth of the functional cosmetics and anti-aging market.
I. 서 론
1. 연구의 필요성 및 목적
현대 사회의 급격한 산업화에 따른 환경 변화는 인간의 건강에 여러 방면으로 부정적인 영향을 미치고 있으며, 그중에서도 피부는 외부 환경과 접점에 위치하여 있는 신체 기관으로서 가장 큰 영향을 받는다. 피부는 물리적 및 화학적 자극으로부터 신체 내부를 보호해 주는 중요한 장벽 역할을 하지만, 외부로부터의 자극이나 내부의 생리적 변화로 인해 피부의 정상적 기능이 저하되어 탄력이 감소하고 주름이 생기는 등 피부 노화현상이 발생하게 된다. 최근 연구에 따르면 자외선, 대기 오염, 중금속 등의 유해 물질이 피부 내 산화적스트레스를 유발하여 피부 노화와 함께 다양한 염증 반응을 촉진 시키는 것으로 사실이 밝혀지고 있다(Kim, 2016). 이와 관련하여 염증 반응이 잘 조절되지 못 할 경우에는 노화가 가속화되거나 노인성 질환으로 이어질 수 있다는 연구 결과도 보고된 바 있다(Kwon et al, 2017). 이에, 피부 건강을 유지하고 염증을 억제하기 위하여 항산화 물질에 대한 현대인들의 관심이 증가하고 있으며, 이는 초고령화 사회에 진입한 사회적 시점에서 더욱 중요하게 다루어지고 있다. 특히 기능성 화장품 분야에서는 피부 노화 방지 및 염증 억제 성분을 찾기 위한 연구가 집중적으로 진행되고 있으나, 일부 합성 성분이 발암물질로 지정되거나 예상치 못한 부작용이 보고되면서, 안전하고 효과적인 천연 소재에 대한 관심이 더욱 커지고 있다(Kim et al., 2017). 합성 염증 억제제의 불확실한 효능과 높은 가격은 문제를 더욱 심화시키고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 최근에는 부작용이 적고, 효과가 입증된 천연 유래 성분을 기반으로 한 기능성 소재 개발이 주목받고 있다(Park, 2019). 특히, 천연 소재에서 추출된 특정 분획물들이 다량의 유효 성분을 함유하고 있어 다양한 생리활성 효과를 보이는 것으로 알려져, 항산화 및 항염증 연구에 중요한 역할을 하고 있다(Lee et al., 2024). 본 연구에 사용된 황금은 전통적으로 항산화, 항염증, 항균 효과가 있는 것으로 잘 알려져 있지만(Cho et al., 2001), 대부분 추출물의 전체적인 효능에 초점을 맞추고 있으며 특정 분획물의 항산화 및 유효 성분에 대한 연구는 상대적으로 미비한 실정이다. 이에 본 연구는 황금 추출물뿐만 아니라 황금 추출물 분획물의 효능도 같이 살펴보고자 한다. 속 썩은 풀(Scutellaria baicalensis)의 뿌리를 약용 부위로 사용하는 황금은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년생 초본 식물로 한국, 중국, 시베리아 동부지역 및 몽골에 분포하며 산지의 풀밭에서 자란다. 황금의 뿌리에는 baicalin, baicalein, neobaicalein, wogonin 등의 플라보노이드류와 같은 생리활성 물질이 함유되어 있으며, 한방에서는 청열, 해독의 목적으로 사용되어 왔다(Yoon et al., 2010). 황금은 항염증 작용이 뛰어나 알러지성 염증 질환 치료제, 불면증, 천식 등의 치료 약으로 사용되며(Choi et al., 2007), 그 외 고지혈증과 동맥경화증 예방, 이뇨 작용이나 항바이러스 효과 및 항균 작용으로 예방과 치료를 위한 의약품 소재로 주목받고 있다. 선행 연구에 따르면 플라보노이드가 염증 관련 효소의 억제제뿐만 아니라 염증 관련 유전자의 발현 조절제 역할로도 보고되어 있으며, Ma et al.(2024)의 연구에 따르면 황금의 주성분인 wogonin, baicalin 및 baicalein은 면역 억제 효과를 촉진하고 TNF, IL, chemokoie 등 염증 매개 인자의 수준을 조절하여 염증성 질환 치료에 사용될 수 있다고 알려져 있다. 이와 같이 황금 추출물에 관한 연구는 다양하지만, 분획물을 활용한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 황금 추출물(Scutellaria baicalensis Extract, SB Ex.) 및 분획물(Scutellaria baicalensis Fraction, SB Fr.)을 활용하여 피부를 개선할 수 있는 항산화 및 항염증 효과를 살펴보고, 기능성 화장품 소재로써의 활용 가치를 탐색해 보고자 한다.
II. 재료 및 방법
1. 추출 및 분획 방법
본 실험에 사용한 황금은 (주)옴니허브(경상북도 의성군)에서 구입한 황금을 이용하여 진행하였다. 황금(500g)을 분쇄 후, 50% 에탄올(EtOH)을 용매(3L)로 하여 3시간 동안 80℃에서 추출을 2회 시행하였으며, 이후 여과된 추출물은 감압 농축기를 사용하여 에탄올을 제거하였고, 동결건조하여 총 8.43g의 황금 추출물(SB Ex.)을 수득(1.68%)하였다. 수득된 황금 추출물을 분획하기 위해 YMC사의 C-18 담체를 이용하여 열린 컬럼크로마토그래피법을 활용한 분획물 제조를 진행하였다. 황금 50% 에탄올 추출물 1.5g을 분획물 제조에 사용했다. 분획은 메탄올(MeOH) 농도 기울기를 적용하여 순차적으로 진행하였다. 먼저 20% MeOH 용액 500 mL를 컬럼에 통과시켜 첫 번째 분획물(SB Fr. 11.595mg)을 수득하였고, 이후 40% MeOH(SB Fr. 2, 4.92mg), 60% MeOH(SB Fr. 3, 1046.4mg), 80% MeOH(SB Fr. 4, 126.3mg), 100% MeOH(SB Fr. 5, 7.7mg) 용액을 각각 500 mL씩 동일한 방식으로 흘려보내어 총 5개의 분획물(SB Fr. 1-5)을 획득하였다. 분획물은 모두 진공상태에서 감압 농축하여 파우더 형태의 것을 이후의 실험에 사용하였다.
2. 세포 배양
본 실험에 사용된 마우스 대식세포주 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 분양받았으며, 배양 시 Fetal Bovine Serum(FBS) 10%와 penicillin/streptomycin 1%가 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지를 사용하였다. 또한, 인간 각질형성세포주인 HaCaT(Human Keratinocyte) 세포는 조선대학교 약학대학(광주, 한국)에서 제공받아 실험에 사용되었다. HaCaT 세포는 FBS 10%와 penicillin/streptomycin 1%이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM) 배지에서 배양되었으며, 37°C, 5% CO₂조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
3. 황금 추출물 및 분획물의 세포 및 생리활성 효과 측정
1) DPPH 라디컬 소거 활성 측정
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)용액은 메탄올을 사용해 0.3 mM 농도로 제조하였고, 라디컬 생성을 위해 30분 동안 반응을 진행하였다. 이후 황금 추출물과 분획물을 각각 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 최고농도를 1 mg/mL 농도로 준비하였다. 양성 대조군은 라디컬 소거 활성 억제에 효과가 있다고 알려진 Ascorbic acid(A-5960, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 추출물과 분획물을 처리한 최고농도와 같은 1 mg/mL 농도로 비교하였다. DPPH 용액과 준비된 시료를 혼합하고 암실에서 30분 동안 반응한 후, microplate에 150 µL씩 각 well에 분주하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, DPPH radical 소거율을 계산하였다.
2) ABTS 라디컬 소거 활성 측정
ABTS(2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 7.4 mM 용액과 Potassium persulfate 2.6 mM 용액을 혼합하여 16-24시간 동안 반응시켜 라디컬을 생성하였다. 황금 추출물 및 분획물은 각각 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 최고농도를 1 mg/mL 농도로 진행하였으며, 양성 대조군은 라디컬 소거 활성 억제에 효과가 있다고 알려진 Ascorbic acid(A-5960, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 추출물과 분획물을 처리한 최고농도와 같은 1 mg/mL 농도로 비교하였다. 이 용액들을 ABTS 용액과 49:1 비율로 섞은 뒤 암실에서 30분간 반응시켰다. 그 후 microplate에 150 µL씩 분주하고, 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 ABTS 라디컬 소거율을 계산하였다.
3) 세포독성 측정
세포 독성 검사는 황금 추출물과 분획물을 마우스 대식 세포주 RAW 264.7 세포와 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포를 대상으로 진행하였다. 세포를 12시간 동안 배양한 후, 황금 추출물과 분획물을 각 농도로 희석하여 추가 배양을 48시간 동안 진행하였다. 이후 5 mg/mL 농도의 (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide, MTT) 용액을 각 웰에 20 μL씩 첨가한 뒤, 37℃ 및 5% CO₂조건의 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상등액을 석션하고, 생성된 보라색 포마잔을 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용해하였다. 마지막으로 세포 독성을 확인하기 위해 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 위해 VersaMaxTM Tunable Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 사용하였다.
4) RAW 264.7 세포에서 Nitrite 생성 억제 측정
마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포를 사용해 5×104 cell/mL 농도로 48-well plate에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 그 후 각 농도별로 황금 추출물과 분획물을 처리하고 3시간 더 배양한 후, Lipopolysaccharide(LPS)를 0.5 μg/mL 농도로 처리하여 염증 반응을 유도하였다. 24시간 후, 세포 상등액에 분비된 Nitrite를 측정하기 위해 Griess 시약 [0.1% (w/v) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine] 및 1% (w/v) sulfanilamide를 5% (v/v) 인산 용액에 용해한 혼합물과 반응시켰다. 마지막으로 VersaMaxTM Tunable Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5) Cytokine 및 Chemokine 생성 억제 측정
Cytokine과 Chemokine 생성 억제를 측정하기 위해 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포를 5×104 cell/mL 농도로 48-well plate에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 이후, 황금 추출물과 분획물을 각 농도로 처리하고, 3시간 후 TNF-α와 IFN-γ를 첨가하여 추가로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, Cytokine 및 Chemokine을 분석하기 위해 ELISA 키트를 사용하여, 세포 상등액을 96-well plate에 분주한 후, 제조사의 권장 방법에 따라 ELISA를 수행하였다. 마지막으로 Cytokine과 Chemokine 생성 억제 효과를 평가하기 위해 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 위해 VersaMaxTM Tunable Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 사용하였다.
6) Western Blotting Analysis
HaCaT 세포를 5×104 cells/well 농도로 24시간 배양한 후, 황금 추출물 및 특정 분획물을 각 농도로 처리한 후 TNF-α와 IFN-γ로 자극을 가하였다. 24시간 후, ICAM-1 수치를 분석하기 위해 Cell scraper를 사용하여 세포에서 단백질을 회수하였다. 단백질 추출은 RIPA lysis buffer를 사용하여 4℃에서 16,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 취득하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하여 VersaMaxTM Tunable Microplate Reader로 측정하였다. 단백질 시료는 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 수행한 뒤, 45V로 1시간 30분 동안 Transfer 과정을 거쳤다. 이후 skim milk를 5%로 희석하여 blocking을 하고, 1× TBST(Tris-Buffered Saline, 0.1% Triton X-100)로 3회 세척한 후, ICAM-1 항체를 1:1000 희석 비율로 하룻밤 반응시켰다. 그 후 second antibody(1:5000)를 1시간 동안 반응시킨 후 1× TBST로 10분씩 4회 세척하였다. 마지막으로 ECL solution을 이용하여 검출을 진행하였으며, band 강도는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 활용하여 분석하였다.
7) 추출물 및 분획물의 함유 성분을 분석하기 위한 TLC 방법
Thin layer chromatography(TLC)를 활용하여 시료에 포함된 성분의 패턴을 분석하였다. 실험에 사용된 TLC 플레이트는 merck사의 silica gel 60 F254 및 silica gel 60 F C18 F254를 사용하였다. 이동상 용매를 TLC 플레이트에 전개한 후, UV 조사를 통해 성분들을 확인하였으며, 10% H2SO4를 이용해 발색시킨 다음 Rf 값을 비교하여 각 성분의 패턴을 분석하였다.
8) HPLC를 통한 추출물 유효 성분 정성 및 정량 분석 방법
HPLC를 활용하여 항산화 성분을 분석하고, 함유 성분의 패턴을 평가하였다. HPLC 장비는 SHIMADZU(Younglin, Korea)를 이용하였으며, 컬럼은 YMC(Younglin, Korea)의 YMC-Triart C-18 ExRS(150×4.6 mm, 5 µm)를 적용하였다. 시료는 황금 추출물 및 특정 분획물과 황금의 유효 성분 baicalein, wogonin의 단일 화합물의 무게를 정밀하게 측정한 후, MeOH에 용해시켜 0.45 ㎛ PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 사용하였다. 황금 추출물 및 특정 분획물의 분석 조건으로 컬럼 온도는 30℃, 주입량은 20 μL로 설정하여 실험을 진행하였다. 이동상으로 H2O 0.1% Formic acid(a)와 Acetonitrile(b)을 사용하였으며, 그라디언트 조건으로 실험을 진행하였다. 0-10 min 동안 b를 20-30%로, 20-30 min 동안 b를 33-60%로 진행하였고, 30-35 min 동안 b를 60-100%로, 35-40 min 동안 b를 100-100%로 40-41 min 동안 b를 100-70%로 41-50 min 동안 b를 70-30%로 진행하였으며 50-51 min 동안 b를 30-20%로 유지하다가, 51-55 min 동안 b를 20-20%로 진행하였다. 유속은 1.0 mL/min로 설정하였으며, 254 nm에서 검출을 진행하였다.
4. 통계처리
본 연구의 결과는 평균값과 표준편차(mean±S.D.)로 표현하였으며, 통계 분석은 GraphPad Prism V5.01 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 처리군 간 차이를 분석하기 위해 one-way ANOVA를 적용하였으며, 사후 검정으로는 Tukey’s multiple comparison test를 사용하였다. 통계적 유의성은 p값이 0.05 미만일 때 인정하였으며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 수준에서 차이가 유의한 것으로 간주하였다.
III. 결과 및 고찰
1. DPPH 라디컬 소거 활성 측정
황금 추출물(SB Ex.) 및 황금 분획물(SB Fr.)의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 라디컬 소거 활성을 확인한 결과는 Fig. 1과 같다. 황금 추출물 및 분획물을 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL 농도로 처리하였다. 황금 추출물은 1 mg/mL 농도에서 34.26±3.15%의 높은 소거 활성을 나타냈으며, 황금 분획물은 4번(SB Fr.4)이 양성대조군인 Ascorbic acid(1 mg/mL)와 비교하였을 때 유사한 항산화 효과를 보이며, 89.24± 0.67%로 가장 높은 소거 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. Kim et al(2006) 연구에 따르면 황금 추출물의 100 μg/mL에서 28.5%, 50 μg/mL에서 12.5%의 소거 활성을 나타냄으로써 본 연구 결과를 지지한다.
2. ABTS 라디컬 소거 활성 측정
황금 추출물 및 황금 분획물의 항산화 효과를 알아보기 위해 ABTS 라디컬 소거 활성을 확인한 결과는 Fig. 2와 같다. 황금 추출물 및 분획물을 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL의 농도로 처리하였을 때, 황금 추출물은 1 mg/mL에서 30.34±0.38%의 소거 활성을 나타냈으며, 황금 분획물의 경우 4번(SB Fr.4)이 79.77±1.07%의 높은 소거 활성을 나타냈다. 이상의 결과들을 종합하여 양성대조군인 Ascorbic acid(1 mg/mL)와 비교하여 보았을 때 황금 분획물 4번에서 가장 우수한 소거 활성 효과가 있음을 확인하였다.
3. 세포독성 측정 결과
마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포와 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포를 이용하여 세포독성 실험을 진행하였다. RAW 264.7 세포에서 세포독성을 확인한 결과는 Fig. 3과 같다. 황금 추출물에서는 100 μg/mL, 분획물 5번에서는 20, 50 μg/mL 농도에서 독성이 관찰되었다. 이러한 결과를 통하여 황금 추출물은 세포독성을 나타내지 않는 100 μg/mL 농도 이하로, 분획물 5번(SB Fr.5)에는 20 μg/mL 농도 이하로 선정하여 염증 억제 효능 분석에 사용하였다. HaCaT 세포에서 세포독성을 확인한 결과는 Fig. 4와 같다. 황금 추출물에서는 모든 농도에서 독성이 나타나지 않았으며, 황금 분획물에서는 분획물 5번이 20, 50 μg/mL 농도에서 독성이 관찰되었다(Data not shown). 이러한 결과를 통하여 황금 추출물과 황금 분획물 1번(SB Fr.1)부터 4번(SB Fr.4)까지는 모두 10, 20, 50 μg/mL 농도로 처리하였고 황금 분획물 5번(SB Fr.5)은 1, 5, 10 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 황금 추출물 및 분획물에서 모두 독성이 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통하여 추출물 및 분획물을 염증 억제 효능 분석에 독성이 관찰되지 않는 농도로 사용하였다.

Cell viability of Scutellaria baicalensis extracts and fraction 1-5 on RAW 264.7 cells. The cells were incubated with indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract and Fraction 1-5 for 24 h. Cell viability were detected by MTT assay. Data are presented as the mean ± S.D of two independent experiments. **p<0.01 and ***p<0.001 as compared to control.

Cell viability of Scutellaria baicalensis extracts and fraction 1-5 on HaCaT cells. The cells were incubated with indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5 for 24 h. Cell viability were detected by MTT assay. Data are presented as the mean ± S.D of two independent experiments.
4. RAW 264.7 세포에서 Nitrite 생성 억제 효과
LPS로 자극받아 염증 반응이 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증 반응을 더욱 증가시키는 인자인 Nitrite 생성 억제를 확인한 결과는 Fig. 5와 같다. 양성대조군인 Sulfuretin 20 μM 처리와 비교한 결과, 황금 추출물의 50 μg/mL 농도에서 Nitrite 생성의 우수한 억제 결과를 확인하였다. 황금 분획물 4번은 모든 농도(10-50 µg/mL)에서 90% 이상의 감소율을 보여 가장 강력한 Nitrite 생성 억제 효과를 나타내었다. 황금 분획물 3번 또한 뚜렷한 억제 효과를 보였으며, 10, 20, 50 µg/mL에서 각각 34.46%, 59.28%, 84.88%의 감소율을 나타냈다. 황금 분획물 2번은 다른 분획물 대비 중간 정도의 억제 효과를 보였으며, 각각의 농도에서 50.37%, 46.08%, 45.32%의 감소율을 기록하였다. 반면, 황금 분획물 1번은 억제 효과가 미미하거나 없는 것으로 나타났으며, 10 µg/mL 농도에서는 -29.33%의 수치를 보여 염증 반응이 오히려 증가하는 경향을 보였다. 황금 분획물 5번은 농도 의존적인 억제 효과를 나타내었으며, 5 µg/mL와 10 µg/mL에서 각각 43.90%와 81.30%의 감소율을 보였다. 결과적으로 황금 분획물 5번(SB Fr.5)의 10 μg/mL에서 Nitrite 생성 억제에 효과가 가장 우수하나 황금 분획물 5번(SB Fr.5)은 10 μg/mL 이상의 고농도에서 독성이 보였다. 반면, 황금 분획물 4번(SB Fr.4)은 20, 50 μg/mL에서 Nitrite 생성 억제 효과가 우수하면서 세포독성이 나타나지 않았다. Park et al(2024) 결과 역시 황금 추출물 50 μg/mL에서 Nitrite 생성 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었으며, 이는 본 연구 결과와 유사하다.

Effects of Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5, on Nitric oxide production in RAW 264.7 cells. The cells were treated with Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5 at the indicated concentrations for 3 hours and then stimulated with LPS(0.5 μg/mL) for 24 hours. Data are presented as mean ± S.D two independent experiments. Sulfuretin was used as a positive control. ###p<0.001 as compared with control. **p<0.01 and ***p<0.001 as compared with LPS only.
5. HaCaT 세포에서 Cytokine 생성 억제 효과
1) 황금 추출물 및 분획물의 IL-6 생성 억제 효과
HaCaT 세포에서 TNF-α와 IFN-γ로 유도된 피부 염증 반응 관련 염증성 사이토카인 IL-6 생성 억제 결과는 Fig. 6과 같다. TNF-α/IFN-γ 처리군은 평균 3556.8 pg/mL로 control 대비 현저하게 증가한 수치를 나타냈다. 황금 추출물은 농도 의존적 억제 효과를 보였으며, 10 µg/mL에서 평균 3556.8 pg/mL, 20 µg/mL에서 2945.7 pg/mL, 50 µg/mL에서 3658.0 pg/mL로 수치를 확인하였다. 황금 분획물 1번의 경우, 10, 20, 50 µg/mL에서 각각 3281.3 pg/mL, 3708.1 pg/mL, 3610.3 pg/mL로 IL-6의 생성을 억제하지 못하고 오히려 증가하는 양상을 보였다. 황금 분획물 2번은 10 µg/mL에서 3143.7 pg/mL, 20 µg/mL에서 3204.7 pg/mL, 50 µg/mL에서 3499.3 pg/mL로 부분적인 억제 효과를 나타냈다. 황금 분획물 3번은 10 µg/mL에서 3314.4 pg/mL, 20 µg/mL에서 3323.8 pg/mL, 50 µg/mL에서 3410.8 pg/mL로 측정되었다. 특히, 황금 분획물 4번은 IL-6 생성을 가장 효과적으로 억제하였으며, 10 µg/mL에서2296.8 pg/mL, 20 µg/mL에서 1856.8 pg/mL, 50 µg/mL에서 1367.9 pg/mL를 기록하며 농도 의존적 감소 경향을 보였다. 마지막으로, 황금 분획물 5번은 1, 5, 10 µg/mL에서 각각 2649.8 pg/mL, 2657.3 pg/mL, 2512.8 pg/mL로 황금 분획물 4번에 이어 두번 째로 우수한 IL-6 생성 억제 효과를 확인하였다. 결과적으로 분획물에서는 황금 분획물 4번의 20, 50 µg/mL 농도에서 염증성 사이토카인 IL-6의 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. Nakamura et al.(2003) 연구에 따르면 황금의 주성분인 baicalein 및 wogonin 성분에 의해 IL-6 생성이 억제된다는 보고가 있다. 이러한 결과를 바탕으로 황금 분획물 4번에는 황금의 유효 성분이 다량 함유되어 있을 것으로 예상되며, 염증 유발 초기 기전을 억제하여 피부의 급성 염증 반응을 완화하는 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

Effects of Scutellaria baicalensis extract and Fraction 1-5 on the secretion of IL-6 in TNF-α/IFN-γ stimulated HaCaT cells. The secretion of IL-6 was measured by using the culture supernatant TNF-α/IFN-γ-stimulated HaCaT cells. The cells were pretreated with the indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5 for 3 h, and then stimulated with TNF-α/IFN-γ (5 ng/mL) for 24 h. Data are represented as the mean ± SD of two independent experiments. ###p<0.001 as compared with control. **p<0.01 and ***p<0.001 as compared with TNF-α/IFN-γ only.
6. HaCaT 세포에서 Chemokine 생성 억제 효과
1) 황금 추출물 및 분획물의 IL-8 생성 억제 효과
HaCaT 세포에 TNF-α와 IFN-γ로 유도된 피부 염증 반응 관련 케모카인 IL-8 생성 억제 효과를 확인한 결과는 Fig. 7과 같다. 황금 추출물은 농도 의존적 억제 효과를 보였으며, 10 µg/mL에서 944.0 pg/mL, 20 µg/mL에서 867.1 pg/mL, 50 µg/mL에서 701.8 pg/mL를 보여 IL-8 생성이 감소하는 경향을 확인하였다. 황금 분획물 1번은 농도에 따라 다소 억제 효과를 보였으나, 10 µg/mL에서는 737.6 pg/mL, 20 µg/mL에서는 685.7 pg/mL, 50 µg/mL에서는 732.7 pg/mL로 나타나 부분적인 억제 효과에 그쳤다. 황금 분획물 2번은 10, 20, 50 µg/mL 농도에서 각각 769.5 pg/mL, 745.7 pg/mL, 814.3 pg/mL를 보였으며, IL-8 생성 억제 효과가 미미한 수준이었다. 반면, 황금 분획물 3번은 10 µg/mL에서 726.5 pg/mL, 20 µg/mL에서 775.7 pg/mL, 50 µg/mL에서 769.2 pg/mL로 나타나 다른 분획물 대비 중간 정도의 억제 효과를 보였다. 황금 분획물 4번은 농도 의존적 억제 효과를 나타내며, 10 µg/mL에서 677.3 pg/mL, 20 µg/mL에서 598.6 pg/mL, 50 µg/mL에서 522.8 pg/mL로 IL-8 생성 억제에 가장 뛰어난 효과를 보였다. 마지막으로, 황금 분획물 5번은 1, 5, 10 µg/mL 농도에서 각각 761.5 pg/mL, 717.3 pg/mL, 734.6 pg/ml로 나타남으로써 황금 분획물 4번에 이어 두번 째로 우수한 IL-8 생성 억제 효과를 확인하였다. 결론적으로 황금 분획물 4번(SB Fr.4)의 20, 50 µg/mL에서 IL-8 생성을 우수하게 억제하는 것으로 나타났다. Nakamura et al.(2003) 연구에 의하면 황금의 유효 성분인 baicalein 및 wogonin이 IL-8 생성을 가장 유의적으로 억제한다고 보고되어 있다. 이러한 결과를 통하여 황금 분획물 4번에는 IL-8 생성을 억제하는 황금의 유효 성분이 많이 함유되어 있을 것으로 예측해 볼 수 있으며, 면역반응과 히스타민 분비를 조절하여 염증 반응을 억제할 수 있다는 것을 유추해 볼 수 있다.

Effects of Scutellaria baicalensis extract and Fraction 1-5 on the secretion of IL-8 in TNF-α/IFN-γ stimulated HaCaT cells. The secretion of IL-8 was measured by using the culture supernatant TNF-α/IFN-γ-stimulated HaCaT cells. The cells were pretreated with the indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5 for 3 h, and then stimulated with TNF-α/IFN-γ (5 ng/mL) for 24 h. Data are represented as the mean ± SD of two independent experiments. ###p<0.001 as compared with control. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 as compared with TNF-α/IFN-γ only.
2) 황금 추출물 및 분획물의 RANTES 생성 억제 효과
HaCaT 세포에 TNF-α와 IFN-γ로 유도된 피부 염증 반응 관련 케모카인 RANTES 생성 억제 효과를 확인한 결과는 Fig. 8과 같다. TNF-α/IFN-γ는 평균 1144.2 pg/mL로 control의 122.4 pg/mL 대비 약 9배 이상 증가하였다. 황금 추출물은 농도에 따라 부분적인 억제 효과를 나타냈다. 10 µg/mL에서 평균 1082.0 pg/mL, 20 µg/mL에서 1049.3 pg/mL, 50 µg/mL에서 950.4 pg/mL로 RANTES 생성이 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 황금 분획물 1번은 10 µg/mL에서 1068.5 pg/mL, 20 µg/mL에서 1043.3 pg/mL, 50 µg/mL에서 963.8 pg/mL를 나타내어 농도 증가에 따라 부분적으로 억제되는 것을 확인하였다. 반면, 황금 분획물 2번은 농도 의존적 억제 효과가 비교적 뚜렷하게 나타났으며, 10 µg/mL에서 1076.5 pg/mL, 20 µg/mL에서 1049.1 pg/mL, 50 µg/mL에서 929.3 pg/mL로 확인되었다. 황금 분획물 3번은 10 µg/mL에서 1082.4 pg/mL, 20 µg/mL에서 1033.7 pg/mL, 50 µg/mL에서 894.9 pg/mL로 나타나 중간 정도의 억제 효과를 보였다.황금 분획물 4번은 RANTES 생성을 가장 효과적으로 억제하였으며, 10 µg/mL에서 1180.8 pg/mL, 20 µg/mL에서 995.7 pg/mL, 50 µg/mL에서 511.4 pg/mL로 농도 의존적으로 RANTES 생성이 현저히 감소하였다. 마지막으로, 황금 분획물 5번은 1, 5, 10 µg/mL에서 각각 1038.7 pg/mL, 907.2 pg/mL, 940.1 pg/mL를 나타내어 부분적인 억제 효과를 확인할 수 있었다. 결과적으로 황금 분획물 4번은 농도 의존적으로 RANTES 생성을 가장 효과적으로 억제하였으며, 50 µg/mL에서 511.4 pg/mL로 RANTES 생성 억제 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다. An et al.(2022) 연구에 따르면 LPS로 자극된 RAW 264.7 마우스 대식세포주에서 황금의 유효 성분인 baicalin이 RANTES 생성을 유의하게 억제한다고 보고되어 있으며, 대식세포에서 황금의 유효 성분인 wogonin 성분에 의한 RANTES의 생성 억제로 항염증 효과를 나타낸다는 Um et al.(2017)의 연구는 본 연구 결과와 관련이 깊을 것으로 사료된다.

Effects of Scutellaria baicalensis extract and Fraction 1-5 on the secretion of RANTES in TNF-α/IFN-γ-stimulated HaCaT cells. The secretion of RANTES was measured by using the culture supernatant TNF-α/IFN-γ stimulated HaCaT cells. The cells were pretreated with the indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5 for 3 h, and then stimulated with TNF-α/IFN-γ (5 ng/mL) for 24 h. Data are represented as the mean ± SD of two independent experiments. ###p<0.001 as compared with control. ***p<0.001 as compared with TNF-α/ IFN-γ only.
3) 황금 추출물 및 분획물의 TARC 생성 억제 효과
HaCaT 세포에 TNF-α와 IFN-γ로 유도된 피부 염증 반응 관련 케모카인 중 TARC 생성 억제 효과 결과는 Fig. 9와 같다. TNF-α/IFN-γ 처리군은 평균 264.8 pg/mL로 control의 130.1 pg/mL 대비 약 2배 증가하였다. 황금 추출물은 농도에 따라 TARC 생성이 점차감소하였으며, 10 µg/mL에서 평균 187.9 pg/mL, 20 µg/mL에서 160.5 pg/mL, 50 µg/mL에서 149.6 pg/mL로 농도 의존적 억제 경향을 보였다. 황금 분획물 1번은 10, 20, 50 µg/mL에서 각각 195.0 pg/mL, 167.1 pg/mL, 152.7 pg/mL를 나타내어 농도 증가에 따라 부분적인 억제 효과가 확인되었다. 황금 분획물 2번은 10 µg/mL에서 254.3 pg/mL, 20 µg/mL에서 206.8 pg/mL, 50 µg/mL에서 190.8 pg/mL로 농도가 증가함에 따라 억제 효과를 나타났다. 황금 분획물 3번은 10, 20, 50 µg/mL에서 각각 242.4 pg/mL, 219.6 pg/mL, 179.5 pg/mL로 중간 정도의 억제 효과를 보였다. 황금 분획물 4번은 10 µg/mL에서 150.6 pg/mL, 20 µg/mL에서 125.4 pg/mL, 50 µg/mL에서 41.6 pg/mL 농도 의존적으로 TARC 생성을 가장 효과적으로 억제하였다. 마지막으로, 황금 분획물 5번은 5, 10 µg/mL에서 각각 137.9 pg/mL와 107.6 pg/mL를 나타내어 농도가 증가할수록 억제 효과가 뚜렷하게 확인되었다. 결과적으로 본 황금 추출물의 20, 50 µg/mL에서 TARC 생성을 억제하는 경향을 나타냈다. 황금 분획물 중에서는 1번(SB Fr.1), 4번(SB Fr.4), 5번(SB Fr.5)에서 모두 염증 억제율을 보였지만, 황금 분획물 4번의 50 µg/mL에서 염증성 케모카인 TARC 생성 억제에 가장 우수한 효과를 나타냈다. Lee et al.(2007) 연구에 따르면 황금의 주성분인 wogonin 성분이 HaCaT 세포에서 케모카인 TARC 생성을 억제하였다고 보고되어 있으며, 이는 본 연구 결과와 같은 맥락이다.

Effects of Scutellaria baicalensis extract and Fraction 1-5 on the secretion of TARC in TNF-α/IFN-γ stimulated HaCaT cells. The secretion of TARC was measured by using the culture supernatant TNF-α/IFN-γ-stimulated HaCaT cells. The cells were pretreated with the indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract and fraction 1-5 for 3 h, and then stimulated with TNF-α/IFN-γ (5 ng/mL) for 24 h. Data are represented as the mean ± SD of two independent experiments. ###p<0.001 as compared with control. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 as compared with TNF-α/IFN-γ only.
7. Western Blotting Analysis
1) 황금 추출물 및 분획물의 ICAM-1 발현 확인
HaCaT 세포에 Western Blotting 분석을 통해 ICAM-1 발현을 조사한 결과는 Fig. 10과 같다. 정상군과 비교했을 때 TNFα와 IFN-γ 처리에 따른 염증 유발군에서 ICAM-1이 발현되었으며, 황금 추출물에서 ICAM-1의 발현 감소가 보이지 않았지만, 황금 분획물 4번에서 ICAM-1의 발현이 유의적으로 감소하였다. 이를 통해 TNF-α와 IFN-γ 자극에 의한 케모카인 및 사이토카인을 억제함으로써 ICAM-1 발현 감소를 확인하였다. Huang et al.(2014) 연구에 따르면 황금의 유효 성분인 wogonin 성분이 ICAM-1 발현을 효과적으로 감소시켰다고 보고되어 있으며, Zhao et al.(2020), Chen et al.(2018) 연구에 의하면 황금의 주성분인 baicalin, baicalein 해당 성분이 ICAM1 발현을 크게 감소시켰다고 보고되어 있다. 이는 본 연구와 관련이 깊으며, 이를 바탕으로 황금 분획물 4번(SB Fr.4)에는 ICAM-1의 발현을 감소시켜 염증 초기 단계를 차단할 수 있는 황금의 유효 성분이 함유되어 있을 것으로 예측된다.

Effects of Scutellaria baicalensis extract, Scutellaria baicalensis fraction 4 on the expression of ICAM-1 in TNF-α/ IFN-γ stimulated HaCaT cells. The expression of ICAM-1 was measured by western blot using cell lysis. The cells were pretreated with the indicated concentrations of Scutellaria baicalensis extract, Scutellaria baicalensis fraction 4 for 3 h, and then stimulated with TNF-α/IFN-γ (5 ng/mL) for 24 h.
8. 황금 추출물 및 분획물의 TLC 패턴 분석 결과
황금의 주성분 wogonin와 baicalin 및 baicalein을 이용하여 분획물과 주요 성분 간의 항산화 및 항염증 효과 상관성을 확인하기 위해 TLC 크로마토그래피를 활용하여 분획물에 포함된 성분을 분석하고자 하였다. 황금 추출물과 분획물 1-5번과 주성분인 wogonin과 baicalin 및 baicalein을 자외선 및 황산을 이용한 발색을 통해 포함된 화합물 spot을 비교 분석한 결과는 Fig. 11과 같다. wogonin과 baicalein spot은 황금 분획물 4번에 함유된 것으로 확인되었으며, baicalin spot은 황금 분획물 5번에 함유한 것으로 확인되었다. 또한, 각 분획물의 spot은 황금 추출물의 spot보다 선명하게 발색 되었다. TLC 크로마토그램의 주성분 비교분석 결과를 종합하였을 때, 분획물 4번(SB Fr.4)이 wogonin과 baicalein로 인해 분획물 중 가장 우수한 항염증 효과가 나타나는 것으로 예측되며, 분획물 3번(SB Fr.3)은 baicalin으로 인해 우수한 항염증 효과가 나타나는 것으로 예측된다.

TLC analysis of components of Scutellaria baicalensis extract and fractions ① wogonin, ② Baicalin, ③ Baicalein, ④ Scutellaria baicalensis extract, ⑤ Scutellaria baicalensis fraction 1, ⑥ Scutellaria baicalensis fraction 2, ⑦ Scutellaria baicalensis fraction 3, ⑧ Scutellaria baicalensis fraction 4, ⑨ Scutellaria baicalensis fraction 5. two compounds ① wogonin and ③ Baicalein, were colored in Scutellaria baicalensis fraction 4.
9. HPLC를 통한 추출물 유효 성분 정성 및 정량 분석 결과
HPLC를 통해 황금 추출물 유효 성분 정성 및 정량 분석 결과는 Table 1과 Fig. 12와 같다. 황금의 주성분인 wogonin, baicalein을 동일한 이동상과 파장을 사용하여 주요 화합물의 함량을 비교 분석하고 정량 평가를 수행하였다. 정량 평가 방법으로는 standard인 wogonin, baicalein의 면적값을 바탕으로 추세선 그래프를 작성한 후, 황금 추출물과 황금 분획물 4번 내 wogonin, baicalein의 HPLC 피크 면적을 추세선에 적용해 함량을 계산하였다. wogonin 으로 작성한 추세선 그래프는 y = 47696x + 91891로 나타났으며, 상관계수(R2)는 0.9968, LOD 및 LOQ는 12.43, 37.65 µg/mL로 확인되었다. baicalein으로 작성한 추세선 그래프는 y = 50227x - 177156으로 나타났으며, 상관계수(R2)는 0.9986, LOD와 LOQ는 8.16, 24.72 µg/mL로 확인되었다. 그 결과 wogonin 함량은 황금 추출물에서 4.89 mg/g으로, 황금 분획물 4번(SB Fr.4)에서 57.65 mg/g으로 나타났으며, baicalein 함량은 황금 추출물에서 14.61 mg/g, 황금 분획물 4번(SB Fr.4)에서 90.99 mg/g으로 나타났다.

HPLC chromatograms of Scutellaria baicalensis extract (SB Ex.), Scutellaria baicalensis fraction 4 (SB Fr. 4), and reference standards wogonin and baicalein. The retention times (RT) of significant peaks were observed at 26.921 min for baicalein and approximately 31.5 min for wogonin. Analysis was conducted at a detection wavelength of 254 nm, indicating the distinct peaks for each component within the sample matrix.
IV. 결 론
본 연구는 황금 추출물과 분획물의 항산화, 세포독성, 항염증 등의 다양한 피부 생리활성 효과를 살펴봄으로써, 기능성 화장품 원료로서의 활용 가능성을 분석해 보고자 하였다. 본 연구의 결론은 다음과 같다.
첫째, DPPH & ABTS 라디컬 소거 활성 측정 결과 황금 분획물 4번의 특정 분획물에서 양성대조군인 Ascorbic acid와 유사한 라디컬 소거 활성을 확인하였다.
둘째, RAW 264.7 세포와 HaCaT 세포에서 독성 평가 결과, RAW 264.7 세포에서는 독성이 나타난 농도가 관찰되어 이를 희석한 뒤 실험을 수행하였다. 반면, HaCaT 세포에서는 세포 생존율이 90% 이상 유지되어 독성이 확인되지 않았다.
셋째, RAW 264.7 세포에서 Nitrite 생성 억제 측정 결과 황금 추출물 및 분획물 모두 양성대조군인 Sulfuretin 보다 Nitrite 생성이 억제가 우수한 것을 확인하였다.
넷째, HaCaT 세포에서 사이토카인 IL-6 생성 억제 측정 결과 황금 분획물 4번 20, 50 µg/mL 해당 농도에서 염증성 사이토카인 IL-6의 생성이 유의미하게 억제되었다.
다섯째, HaCaT 세포에서 케모카인 IL-8, RANTES, TARC 생성 억제 측정 결과 황금 분획물 4번에서 케모카인을 현저하게 억제하였다.
여섯째, HaCaT 세포에서 ICAM-1 발현을 측정한 결과 황금 추출물을 분획물 4번과 비교하였을 때 황금 분획물 4번에서 ICAM-1의 발현을 현저하게 감소시켰다.
일곱째, 황금 추출물과 분획물의 TLC 분석 결과 황금 추출물 및 분획물 4번에서 황금의 유효 성분인 wogonin, baicalein 성분을 확인하였다.
여덟째, HPLC를 활용한 추출물 유효 성분의 정성 및 정량 분석 결과 황금 분획물 4번에서 wogonin 함량은 황금 추출물 보다 11.8배, baicalein 함량은 황금 추출물보다 6.2배 함유되어 있는 것을 확인하였다.
위의 결과를 종합하여 볼 때 황금 추출물 및 분획물에서 피부 생리활성에 관한 연구 결과를 객관적으로 증명하였다. 본 연구에서는 황금 분획물 4번에서 다양한 생리활성 효과에서 우수한 특정 분획물을 확인하고 유효 성분을 규명한 것에 의의가 있다. 또한 특정 분획물에 유효 성분이 추출물보다 다량 함유되어 있는 것을 확인하였다. 추후, 우수한 효능을 확인한 특정 분획물의 세부 기전 연구와 실증적 임상 연구가 필요하다고 사료되나, 이와 같은 결과는 황금 추출물 및 분획물이 화장품 소재로써 활용이 우수하다는 것을 시사하며 특정 분획물에 대한 기능성 성분으로서의 이용 가치가 우수하다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 연구 결과를 바탕으로 천연 유래 화장품 소재 개발을 위한 기초 자료로써 활용되길 바라며, 기능성 화장품 산업과 항노화 시장 활성화에 도움이 되기를 기대한다.