J Korean Soc Cosmetol > Volume 30(6); 2024 > Article
소백호 잎 추출물의 생리활성 연구

Abstract

Artemisia frigida is a member of the Compositae family and is widely used in traditional medicine for treatment of diverse disease. The anti-oxidant, anti-inflammatory, and anti-melanogenic activities of A. frigida leaf extract using aqueous (A. fridia water, AFW) and ethanol (A. fridia ethanol, AFE) solvents were investigated. The anti-oxidant activity was determined using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) assays, revealing it to be high. The effect of anti-inflammation on the A. frigida leaf extract was assessed in LPS stimulated murine macrophage cell line, RAW264.7. AFW extract suppressed the LPS-stimulated inflammatory responses in RAW 264.7 macrophage cells by significantly reducing nitric oxide production in a concentration-dependent manner. This extract also inhibited interleukin-6 (IL-6) production and suppressed the protein expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophage cells. Furthermore, the AFW and AFE showed 30.190% and 24.295% inhibition of tyrosinase activity and 50.190% and 50.061% inhibition of DOPA oxidation activity at 1 mg/mL. These results suggest that Artemisia frigida leaf has a great potential as sources of bioactive compounds which could be used as functional cosmetic ingredients in skin care.

I. 서 론

최근 화장품은 더 이상 미용을 위한 제품이 아닌 피부치료 및 피부개선을 위해 수반되는 필수품으로 그 영역이 점차 확대되고 있다. 특히, 환경오염과 감염병에 의한 마스크 착용 등으로 인한 새로운 피부 위해요소에 대해 화장품 시장에서 개인별 피부상태 및 피부트러블 맞춤형 제품 수요 증가로 나타나고 있다. 이러한 변화는 화장품 성분과 재료에 대한 과학적 근거 기반의 인식이 수요자들에게 점차 확산되고 있고, 그 결과 항염, 항균, 항오염, 피부장벽 강화 등의 화장품 신기술에 의한 높은 안전성과 유효성을 갖춘 수많은 제품이 끊임없이 개발되고 있다(Kim et al., 2022, Lee et al., 2021). 이러한 안전성과 유효성이 확보된 화장품 성분의 중요성은 새로운 소비 형태를 형성하고 있으며, 이는 기능성화장품 수요 증가를 가속화하고 있다.
피부는 외부환경으로부터 신체를 보호해주는 장벽으로 특히 수분 손실을 방지하고 해로운 병원균이 체내로 침투하지 못하도록 막아주는 역할을 한다. 이러한 피부장벽 기능은 각질세포, 각질세포외막, 각질세포간 지질, 각질교소체로 구성된 각질층 구조체를 통해 나타난다(Oh & Jang, 2015).
따라서 피부장벽의 가장 큰 기능은 체내 과도한 수분 손실을 방지하고, 체내로 유입되는 화학물질, 미생물, 알러젠과 같은 유해물질을 차단한다. 피부장벽은 각질세포의 분화와 각화 과정 간의 균형을 통해 형성되며, 피부장벽 기능 이상은 건조함, 가려움증 유발, 다양한 외부 자극 또는 감염에 대한 민감도를 증가시켜 접촉성 피부염과 피부 감염의 큰 요인으로 작용한다(Lee & Kim, 2022). 그러므로 피부장벽 기능 손실을 방지하거나 기능을 더욱 강화하기 위한 기술 개발은 기능성화장품 개발 영역의 한 부분으로 자리 잡게 되었으며, 이를 해결하기 위한 노력으로 피부염증 개선 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
국화과(family Asteraceae) 쑥 속(Artemisia genus) 식물은 약 500 여종의 허브와 관목으로 구성되어 있으며, 2년마다, 1년생 또는 다년생으로 유럽, 아시아, 북아프리카 및 북미의 온대 지역에 널리 분포하고 있다(Rauzi, 1982). 이제까지 보고된 소백호(A. frigida)에 관한 연구 결과들을 살펴보면, 미국에서 채취된 소백호 잎과 줄기를 포함한 지상부(aerial parts)의 메탄올추출물로부터 분리된 flavonoid 성분 규명을 통한 항산화 활성(Liu & Mabry, 1981), 카자흐(Kazakh) 전통 약용식물로 상처(wounds), 독감, 간질환, 두통 등과 같은 질병 치료 효능(Xu et al., 2012)등과 같은 천연식물자원으로서의 생리활성 연구와 중앙아시아에서 처음 유래된 것으로 알려진 소백호가 이질적인 환경 조건하에서 정착하기 위한 결과로 다양한 종이 발생하고, 이로 인해 현재와 같이 몽골의 대초원 및 북미에 널리 분포한다는 생태학적 연구(Oyundeger et al., 2021)가 주를 이루는 반면, 소백호 잎의 화장품 소재로서의 활성 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 소백호 잎을 소재로 초순수물과 에탄올을 사용하여 2종 추출물을 제조하고, 이를 대상으로 생리 활성을 평가하여 천연식물 기반 기능성화장품 원료로서의 가능성을 평가하고자 하였다.

II. 재료 및 방법

1. 시료 추출 및 분획

본 연구에서 사용된 연구 소재 A. frigida의 잎은 2023년 4월 세척 및 건조한 뒤 판매하는 것을 구매하여 사용하였다. 추출은 Fig. 1과 같이 A. frigida 30 g을 60℃에서 초순수물과 에탄올 각각 3 L에 침전시킨 뒤, 15시간 방치 후 No. 2 filter paper(Whatman, UK)로 여과하였다. 여과액을 감압농축 한 뒤 동결건조를 통해 용매를 제거하였으며, 최종 건조분말 형태의 시료를 100 mg/mL로 제조하여 초저온 냉동고에 보관한 후 사용하였다(Song et al., 2024).

2. 항산화 활성 측정

2) DPPH radical scavenging assay

소백호 잎의 물추출물과 무수에탄올추출물의 항산화 활성을 조사하기 위해 DPPH anion radical compound를 이용하였다(Blois, 1958). 농도별 희석하여 제조된 시료에 0.1 M DPPH 용액 첨가하고 10초 동안 vortex를 이용하여 혼합하고 상온에서 암조건 상태로 방치하였다. 30분 경과 후 microplate reader (517 nm)기를 사용하여 흡광도를 측정하였으며 이 때 양성 대조 물질 ascorbic acid(Sigma, MO, USA)를 함께 사용하였다.

2) ABTS cation radical scavenging assay

소백호 잎 2 종 추출물의 항산화 활성을 ABTS cation radical을 제조하여 측정하였다(Re et al., 1999). 먼저 7 mM의 ABTS 수용액에 2.5 mM potassium persulfate를 첨가하여 상온에서 방치하였다. 20 시간 경과 후 ABTS cation radical과 각 시료를 섞어 30분 반응시키고 microplate reader(734 nm) 기를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이 때 양성 대조 물질 ascorbic acid를 함께 사용하였다.

3) 소백호 잎 추출물 내 폴리페놀 함량 측정

물과 에탄올 용매를 이용한 소백호 잎 추출물의 폴리페놀 성분은 Folin-Denis 방법(Folin & Denis, 1912)을 이용하여 측정하였다. 농도별로 희석한 시료에 Folin-Ciocalteau’s phenol reagent를 첨가하고 5분간 방치한 후 10% sodium carbonate를 추가로 첨가하였다. 30분 후 혼합액을 원심분리한 후 상등액을 대상으로 microplate reader(760 nm)기를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이 때 대표적인 폴리페놀 gallic acid를 농도별로 희석하여 표준검량곡선을 작성하는데 이용하였다(Yige & Lee, 2023).

3. 항염 활성 측정

1) RAW264.7 세포 독성 측정

RAW264.7 세포에 대한 소백호 2종 추출물의 독성 여부를 조사하기 위해 3×104 cell/well이 되도록 96 well plate well 당 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 배양하고, 농도별 시료 및 lipopolysaccharide(LPS, 100 ng/mL, Sigma, MO, USA)를 처리하여 18시간 배양하였다. WST-8 시약을 최종 농도 10%가 되도록 첨가하고 4시간 추가 배양 후 흡광도(450 nm)를 측정하였다.

2) LPS로 활성화된 RAW264.7 세포에서 산화질소 생성량 측정

RAW264.7 세포를 5×105 cell/well이 되도록 24 well plate에 0.5 mL씩 첨가하여 24시간 배양하고, 농도별 시료 및 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 세포 배양액과 동량의 Giress 시약을 섞은 후 10분 후 흡광도(550 nm)를 측정하였다. NO 생성량은 농도별로 제조한 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다(Suriyaprom et al., 2023).

3) LPS로 활성시킨 RAW264.7 세포에서 싸이토카인 분비 측정

RAW264.7 세포를 24 well plate well에 1×105 cells로 배양하여 LPS와 각 시료로 세포에 18시간 처리하였다. 배양액을 시료로 IL-6 ELISA kit를 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다(Kandilarov et al., 2023).

4. 미백 활성 측정

1) In vitro tyrosinase 활성 저해능 측정

티로시나아제 활성 억제능은 식품의약품안전처(https://www.mfds.go.kr/index.do) 피부 미백에 도움을 주는 기능성화장품 유효성 평가 가이드라인에 공시된 시험법에 따라 측정하였다(식품의약품안전처, 2020). 200 mM의 sodium phosphate buffer(pH6.5)와 각 추출물을 동량으로 혼합한 후 1.5 mM L-tyrosine을 첨가하였다. 버섯으로부터 추출한 Tyrosinase(220unit/mL) 효소를 기질의 1/2로 모든 시료에 첨가하여 혼합한 후 10분간 방치하고 microplate reader(490 nm) 기를 사용하여 흡광도를 측정하였다(Shao & Lee, 2024).

2) In vitro DOPA oxidation 억제능 측정

Tyrosinase 저해활성 측정을 L-DOPA를 기질로 하여 tyrosinase에 의해 생성되는 중간 단계인 DOPA chrome의 생성 정도를 분광광도계로 측정하였다. 먼저 농도별로 희석한 시료를 L-DOPA와 mushroom tyrosinase가 포함된 100 mM의 sodium phosphate(pH 6.5)에 첨가하고 37℃에서 20분 반응시킨 후 흡광도(475 nm)를 측정하였으며 양성 대조물질로 kojic acid를 사용하였다(Strzępek-Gomółka et al., 2021).

5. 통계처리

본 연구 결과에 기재된 모든 결과는 3회 이상 반복 수행하여 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였으며 통계 분석은 One-Way ANOVA 또는 Student’s T-test (GraphPad Prism 6.0 Software)를 수행하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

III. 결과 및 고찰

1. 소백호 잎의 물 추출물과 무수에탄올 추출물 제조

소백호 잎 건조 중량 30 g을 각각 물과 무수에탄올 용매를 사용하여 추출, 여과, 감압농축 및 동결 건조한 결과 Fig. 1과 같았다.
동결건조 후 물 추출물(A. frigida water extract, AFW)의 최종 분말 중량은 4.04 g, 무수에탄올 추출물(A. frigida ethanol extract, AFE)의 중량은 1.82 g으로 확인되었으며, 최종수율은 AFW가 13.46%, AFE가 6.06%로 물 용매에 의한 추출 효율이 에탄올 용매보다 높은 효율을 나타냈다(Table 1). 러시아산 소백호 분말 100 g에 70% 메탄올을 첨가하여 50℃ 조건하에서 1시간 sonication한 최종추출물의 건조중량이 22.14 g이었다고 보고한 선행연구결과 비교하여 본 연구에서 사용된 무수에탄올 추출 수율이 낮음을 확인하였다(Olennikov et al., 2019). 이는 화장품 원료 선택 시 수익성에 큰 영향을 미치는 수율 향상을 고려할 때 추출 용매 선택, 소재의 재배환경 및 추출 세부 방법 등이 주요 인자로 작용함을 시사한다.

2. 항산화 효능

1) 소백호 잎 추출물의 DPPH 라디컬 소거능

DPPH는 안정한 자유라디컬 화합물로 517 파장에서 보라색을 나타내는 원리로 천연물의 항산화 활성 성분 탐색에 주로 이용되고 있다(Yun & Kim, 2024). 소백호 잎의 물과 에탄올추출물의 DPPH 라디컬 소거 활성 결과, 시료 농도가 증가할수록 라디컬 소거 활성이 점차 증가하였다(Fig. 2A).
양성대조물질로 사용된 ascorbic acid의 IC50 값이 7.954 ㎍/mL일 때, AFW는 149.257 ㎍/mL로 18.7배 높게 나타났다. 그러나 AFW의 DPPH 라디컬 소거능은 AFE의 IC50 값(201.365 ㎍/mL)과 비교하여 1.35배 더 우수함을 확인하였다(Table 2). 튀니지에서 채취된 소백호 지상부 오일추출물의 DPPH 라디컬 소거능은 추출물 농도(50-400 ㎍/mL) 의존적으로 증가하였으며, IC50은 양성대조군 BHT가 (37.8 ㎍/mL)일 때 50 ㎍/mL으로 보고되어 본 연구 결과와 맥을 같이하며, 소백호 잎 추출물의 DPPH 라디컬 소거능이 우수함을 확인하였다(Kadri et al., 2011).

2) 소백호 잎 추출물의 ABTS cation 라디컬 소거능

소백호 2종 추출물을 농도별로 희석하여 제조한 시료를 사용하여 ABTS cation 라디컬 소거능을 수행한 결과 Fig. 2와 같다. DPPH 라디컬 소거능 결과와 유사하게 AFW와 AFE 시료 모두 추출물의 농도가 높아짐에 따라 라디컬 소거능이 증가하였다(Fig. 2B). 또한 양성대조물질 ascobric acid의 IC50 값이 37.362 ㎍/mL일 때, AFW와 AFE의 IC50 값은 각각 522.314 ㎍/mL, 695.051 ㎍/mL로 나타나 AFW의 항산화 활성이 AFE 보다 탁월함을 확인하였다(Table 2). 이러한 결과는 동일 속(genus)에 속하는 A. annua, A, sieversiana, A. wellbyi 3종의 분획별(petroleum ether, chlorofrom, ethyl acetate, n-butanol, water) ABTS 라디컬 소거능 결과 3종 모두 유의미하게 ABTS 라디컬 소거능을 나타낸 선행 연구 결과와 비교하여 소백호 잎 추출물 역시 항산화제로서의 개발 가능성이 있음을 시사한다(Liu et al., 2023).

3) 소백호 잎 추출물 내 폴리페놀 함량

소백호 잎의 물추출물과 에탄올추출물에 함유되어 있는 폴리페놀 함량을 Folin-Denis 시험법으로 측정한 결과 Table 2와 같다. AFW의 폴리페놀 함량을 건조중량 g당 표준물질 gallic acid mg으로 표기한 결과 57.458 mgGAE/g, AFE는 50.479 mgGAE/g으로 확인되었다. 이는 소백호를 허브 차로 음용 시 항산화 효능에 기여하는 주요 성분이 caffeoylqinic acids, flavonoid glycosides 및 flavonoid aglycones와 같은 친수성 폴리페놀이 19가지임을 규명한 연구결과와 맥을 같이 한다(Olennikov et al., 2019).

3. 항염 효능

1) 소백호 잎 추출물의 NO 생성 저해능

대식세포에서 염증 매개인자인 nitric oxide (NO)는 세균을 죽이거나 종양을 제거하는 기능을 하지만, 과도한 NO 형성은 산화적 스트레스로 작용하여 세포 손상의 원인이 되며, 염증 및 암을 유발한다(Papi et al., 2019). 따라서 LPS로 활성시킨 RAW264.7 세포에 소백호 2종 추출물 처리 후 NO 생성 변화를 확인한 결과 AFW와 AFE 모두 추출물 농도가 증가할수록 NO 생성이 감소하였으며, 특히 AFE의 억제능이 높게 나타났다(Fig. 3B). 영향을 조사하였다. 이 때 처리된 소백호 잎의 추출물 농도(0.02-0.2 mg/mL) 처리에 의한 세포 독성은 없었다(Fig. 3A).

2) 소백호 잎 추출물의 IL-6 분비 억제능

대식세포는 선천면역세포로서 염증 유발 인자에 의해 활성화되면 IL-6와 같은 pro-inflammatory cytokines의 생성을 증가시켜 염증을 증폭시키는 중요한 기능을 한다(Jang et al., 2024). LPS로 활성 시킨 RAW264.7 세포에서 소백호 추출물에 의한 IL-6의 분비량 변화를 확인한 결과, NO 생성 결과와 동일하게 AFE에 의한 IL-6 분비량 저하가 0.05 mg/mL 농도 이상에서 뚜렷하게 나타났다(Fig. 3C).
따라서 소백호 지상부(aerial parts) 물 추출물이 TNF-α와 IL-1β의 분비 역시 유의하게 감소시켰다고 보고한 선행연구 결과와 (Wang et al., 2016) 더불어 본 연구 결과는 소백호 추출물이 대표적인 pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6) 분비억제를 통한 염증 완화제로서의 활용 가능성이 높을 것으로 예상된다(Xue et al., 2020).

4. 미백 효능

1) In vitro tyrosinase enzyme 억제능

피부 자연색소인 멜라닌은 멜라닌 합성 효소인 티로시나제(tyrosinase)에 의해 생성되므로 티로시나제 억제제 개발이 미백 기능 화장품 성분 연구에서 가장 활발히 진행되고 있다(Xu et al., 2022). 소백호 잎 2종 추출물의 티로시나제 활성을 확인한 결과, 미백제로 잘 알려진 알부틴(AR, 1 mg/mL)의 억제능(83.743%)과 비교하여 다소 낮았으나, AFW와 AFE 모두 농도 의존적으로 티로시나제 억제능이 증가하였다(Figure 4A).
최근 소백호와 동일 속의 천연식물인 A. capillaris 에센셜 오일 추출물이 B16F10 세포 모델에서 tyrosinase-related protein (TRP)-1, -2 및 MITF, tyrosinase를 포함한 멜라닌 형성 유전자의 발현을 감소시킨다고 보고하였다. 따라서 본 연구 결과는 추후 멜라닌 형성에 관련된 TRP-1, -2 및 MITF 유전자 발현 수준 등의 미백 기전 연구에 대한 기초자료로서 가치가 있다고 판단된다(Kim et al., 2022).

2) DOPA oxidation 억제효능

티로시나제는 1단계로 아미노산의 일종인 L-tyrosine을 L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)로 수산화시키고, 2단계에서 L-DOPA를 dopaquinone으로 산화시키는 촉매작용을 통해 최종적으로 melanin polymer를 생성하는데 중요한 효소이다(Mohammad et al., 2019). 소백호 잎 추출물이 DOPA 산화 반응을 저해하는지 확인한 결과, 티로시나제 효소 억제 결과와 유사하게 AFW와 AFE 모두 처리된 농도에 비례하여 DOPA 산화저해를 증가시켰다. 또한 동일 농도 조건(1 mg/mL)하에서 DOPA 산화 저해능은 AFW와 AFE가 각각 50.19%, 50.061%로 양성대조군인 AR(41.816%) 보다 높게 나타났다(Figure 4B). 갯제비쑥(A. littoricola) 물 분획물 (10-50 ㎍/mL)의 L-DOPA oxidation 저해능이 양성 대조군인 kojic acid (10 μM)에서 49.4%일 때 14.2%-33.7%로 나타나, 본 연구에서 확인된 AFW의 저해능이 탁월함을 확인하였다(Yang et al., 2023).
이러한 결과는 소백호 잎 추출물이 갈변억제제(antibrowning agent) 또는 미백 성분(skin-whitening compounds)으로 각각 식품과 화장품 산업 분야에서 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.

IV. 결 론

오래전부터 유용한 약용식물로 사용되어져 온 소백호 잎의 기능성 화장품 소재로서의 가치를 확인하고자, 물과 에탄올 두 가지 용매추출물의 항산화, 항염 및 미백 효능을 조사하였다. 소백호 잎 물추출물(AFW)과 에탄올추출물(AFE)의 수율은 각각 13.46%, 6.06%로 물에 의한 추출 수율이 더 높은 값을 나타냈다. 소백호 잎 2종 추출물의 DPPH 라디컬 및 ABTS cation 라디컬 소거능 측정 결과, 모든 추출물 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였으며, AFW가 AFE보다 높았으며, AFW의 폴리페놀은 57.458 mgGAE/g, AFE는 50.479 mgGAE/g으로 각 추출물 내 폴리페놀 함량 측정 결과 역시 AFW가 높게 나타나 소백호 잎 물추출물의 항산화 효능이 우수함을 확인하였다.
쥐의 면역세포인 RAW264.7 macrophage 세포에 소백호 잎 용매별 추출물에 의한 세포 독성이 없는 농도 조건에서 LPS에 유도되는 염증 매개인자 NO의 생성 억제를 확인한 결과, AFE 처리 시 AFW보다 더 높은 억제 효능을 확인하였다. 이러한 결과는 LPS에 의해 증가된 염증성 싸이토카인 IL-6 분비량이 AFW 보다 AFE 처리에 따른 감소가 더 효과적으로 나타나 소백호 잎 에탄올추출물의 항염 효능이 물추출물보다 효능이 탁월함을 확인하였다.
마지막으로, 소백호 잎 추출물의 미백 효능을 L-tyroinse과 L-DOPA 두 가지 기질을 사용하여 멜라닌 합성 2단계에 걸쳐 작용하는 티로시나제 효소 활성 정도를 확인하였다. 그 결과, AFW와 AFE 모두 L-tyroinse을 L-DOPA로 L-DPA를 dopaquinone으로 분해하는 티로시나제 활성을 감소시켜 소백호 잎 추출물이 미백제 후보제로서의 가능성이 우수함을 확인하였다.

Fig. 1.
Flow chart of extraction process
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Fig. 2.
Radical scavenging activities of various concentrations of A. fridia leaf extracts on DPPH(A) and ABTS cation(B). AFW, A. frigida water extract; AFE, A. frigida ethanol extract. Values are presented as mean±S.D.(n=3).
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Fig. 3.
Effect of A. frigida leaf extracts on cell viability(A), NO production(B), and IL-6 secretion(C) in LPS-activated RAW264.7 macrophages. Cells were pre-treated with LPS(100 ng/mL) for 1 h and then exposure to the indicated concentration of A. frigida leaf extracts. AFW, A. frigida water extract; AFE, A. frigida ethanol extract; LPS, lipopolysaccharide. Values are presented as mean±S. D.(n=3).
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Fig. 4.
Inhibitory effect of A. frigida leaf extracts on mushroom tyrosinase(A) and DOPA oxidation. AFW, A. frigida water extract; AFE, A. frigida ethanol extract; AR, arutin. Values are presented as mean±S.D.(n=3).
JKSC-2024-30-6-1456f4.jpg
Table 1.
Extraction Yield A. frigida Leaf Extracts
Sample Yield (%)
AFW 13.467
AFE 6.067

AFW, A. frigida water extract; AFE, A. frigida ethanol extract.

Table 2.
Evaluation of Antioxidant Activities of A. frigida Leaf Extracts from DPPH, ABTS, and TPC Assay
IC50 (μg/mL) DPPH assay ABTS assay TPC (mgGAE/g)
AFW 149.257±0.001 522.314±0.001 57.458±0.589
AFE 201.365±0.003 695.051±0.004 50.479±0.147
AA 7.954±0.003 37.362±0.021

AFW, A. frigida water extract; AFE, A. frigida ethanol extract; AA, ascorbic acid; TPC, Total polyphenol content; GAE, Gallic acid equivalent. Values are presented as mean±S.D.(n=3).

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