*Corresponding author: Mi-Young Yun Tel : +82-10-8811-8323 E-mail : I. 서 론
현대 사회에서 평균 수명의 증가와 함께 고령화가 심화되며, 노화에 따른 건강 문제와 외모 변화는 개인의 삶의 질에 중대한 영향을 미치고 있으며 이러한 관심은 천연물 소재로 관심을 갖게 되었다(United Nations, 2022; Lee & Lee, 2020). 노화는 신체적, 생리적 변화를 동반하며, 특히 피부 노화는 외부 환경과 가장 먼저 접촉하는 장기인 피부의 구조적, 기능적 변화를 초래한다(Markiewicz et al., 2021). 이러한 피부 노화는 크게 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(extrinsic aging)로 나뉘며, 자외선(UV)에 의한 광노화(photoaging)는 외인성 노화의 주요 원인으로 지목된다(Fisher et al., 2002; Krutmann et al., 2017).
광노화는 피부에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과잉 생성과 항산화 시스템의 약화를 유도하여 콜라겐과 엘라스틴과 같은 세포외기질 성분을 분해함으로써 주름, 탄력 저하, 색소 침착과 같은 가시적인 노화 징후를 초래한다(Wang et al., 2020; Gilchrest, 2013). 이에 따라 피부 노화와 자외선 손상을 예방하고 개선하기 위한 다양한 연구가 진행 중이며, 특히 천연물 기반의 항산화 소재는 높은 안전성과 효과를 바탕으로 주목받고 있다(Georgiev et al., 2021).
중국 고대 문헌 *태평성혜방(太平聖惠方)*에 기록된 칠백고(七白膏) 처방은 피부 미백과 재생 효과로 알려진 대표적인 한방 처방으로, 이 처방에 포함된 백복령(白茯苓), 백출(白朮), 백지(白芷) 등의 성분은 항산화 및 항염 효과를 가진 것으로 보고된 바 있다(Li et al., 2018; Zhang et al., 2022). 특히 전통 의학은 현대 과학적 방법론으로 재해석될 때 그 활용 가능성이 더욱 커지며, 천연 성분을 활용한 피부 노화 방지 소재의 연구는 기능성 화장품 개발과 더불어 의약품 및 건강기능식품 분야에서도 큰 가치를 지닌다(Pandey et al., 2021).
따라서 본 연구는 송대(宋代) 태평성혜방에 수록된 칠백고 처방의 주요 성분 추출물이 UV로 유도된 피부 손상과 주름 형성 억제 효과를 분석하고자 한다. 이를 통해 전통 의학의 현대적 재해석 가능성을 탐구하고, 기능성 화장품 소재 개발의 과학적 근거를 제공하고자 한다.
II. 이론적 배경
태평성혜방(太平聖惠方)은 북송(北宋) 시대에 편찬된 방서로, 다양한 질병 치료를 위한 처방을 체계적으로 정리한 한의학서이다. 이책에 수록된 칠백고(七白膏)는 피부 미백과 재생 효과로 널리 알려진 처방으로, 주로 백지(白芷), 백렴(白斂), 백출(白朮), 백복령(白茯苓), 백급(白芨), 백부자(白附子), 백세신(白細辛) 등의 약재로 구성되어 있으며, 이들 약물은 주로 항산화, 미백, 항염 효과를 가지며, 전통적으로 기미, 잡티 개선과 피부 보습 및 탄력 증진에 활용되어 왔다. 백지(Angelica dahurica)는 쿠마린 계열 화합물을 함유하고 있어 항산화 및 항염 효과가 뛰어나며, 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 작용을 돕는다고 알려져 있다(Li et al., 2019). 백렴(Bletilla striata)은 플라보노이드와 다당류 성분이 함유되어 항산화 및 항균 작용을 나타내고, 상처 치유와 피부 재생을 촉진하는 효과가 있다(Wang et al., 2020). 백출(Atractylodes macrocephala)은 폴리페놀 성분이 풍부하여 항산화 활성이 높으며, 피부 장벽 강화에 기여하며, 항염 작용을 통해 민감성 피부 개선에 도움을 준다(Chen et al., 2021). 백복령(Poria cocos)은 트리테르페노이드 성분이 함유되어 있어 항산화 및 면역 조절 효과와 피부 보습 및 진정 효과가 뛰어나 피부 건강을 유지하는 데 도움을 준다(Zhao et al., 2018). 백급(Bletilla striata)은 탄닌 및 점액 성분이 풍부하여 피부 보호막을 형성하고 피부 재생을 촉진하고, 상처 치유와 미백 효과를 제공하여 손상된 피부 회복을 돕는다(Wang et al., 2020). 백부자(Aconitum koreanum)는 알칼로이드 성분이 함유되어 있으며, 항산화 및 항염 작용을 통해 피부 건강 개선에 기여하며, 주름 개선 및 탄력 증진 효과가 있다(Kim et al., 2017). 백세신(Asarum sieboldii)은 정유 성분과 플라보노이드가 함유되어 있어 항산화 및 항균 작용하며, 혈액순환을 촉진하여 피부 톤 개선과 영양 공급에 도움을 준다(Park et al., 2016).
칠백고의 약재들은 각각 강력한 항산화 및 항염 효과를 가지며, 복합적으로 작용하여 피부 미백과 재생을 촉진한다. 최근 연구에서도 각 성분의 항산화 및 미백 효과가 입증되고 있다. 이를 기반으로 한방 화장품 및 치료제로의 응용 가능성이 높으며, 추가적인 임상 연구를 통해 효능을 더욱 구체적으로 입증할 필요가 있다.
III. 내용 및 방법
1. 물질추출
본 연구는 중국 고대문헌 송대 “태평성혜방”에 나온 처방으로, 칠백고(백지, 백련, 백출, 백복령, 백급, 백부자, 세신)를 건조된 생약을 구입하여 실험에 사용하였다. 약재를 추출하기 위해 백지, 백렴, 백출 각각 30g, 백복령 9g, 백급 15g, 백부자, 백세신 각각 9g씩 총 51.0g을 70℃ 물 1L를 2시간 동안 열수 추출하여 감압하여 5.7g을 얻었다(S-W). 동일한 양에 50℃ 70% 에탄올 1L를 2시간 동안 교반하고 여과한 후 감압 농축하여 6.2g을 얻었다(S-E).
2. 기기
본 연구에 사용된 기기는 열탕추출기(대웅, Korea), plate shaker(Lab-Line, Co., U.S.A.), Microwave (LG, Co., Korea), CO2 배양기(Forma scientific Co., U.S.A.),autoclave(Sanyo, Co., Japan), Demo bella(Sant boi. Co., Korea), micropipet(Gilson, Co., France), clean bench(Vision scientific Co., Korea), vortex mixer(Vision scientific. Co., Korea), spectrophotometer(Shimazue, Co., Japan), water bath(Vision scientific Co., Korea), centrifuge(Sigma, Co., U.S.A.)를 사용하였다.
3. 세포배양 및 독성 평가
HDFn 세포를 DMEM에 10% FBS를 첨가하여 사용하였다. 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 배양된 세포는 완충용액 PBS를 이용하여 세척 후 trypsin-EDTA로 세포를 분리하였다. 원심분리하여 얻은 cells pellet에 새로운 DMEM을 같은 양의 trypan blue와 mix 후 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다.
HDFn 세포를 96-well plate에 1×104 cells/wellfh incubater에서 24시간 안정화를 확인한 후, 시료를 농도별로 처리하고 48시간 후 MTT 방법으로 처리하고 540 nm Micro plate reader에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다.
4. 항노화 효과
1) MMP-1 억제활성
HDFn 세포를 5×104 cells/well 농도로 96-well pleat에 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 10% FBS+DMEM을 이용해 T75에서 배양한 세포를 PBS 완충용액으로 세척하고, Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 분리하였다.
이후, PBS로 세척한후 후 PBS가 포함된 상태로 UVA를 6 J/cm2로 조사하였다. 그 후, FBS가 제거된 배지로 시료를 각각 100, 50 ㎍/㎖씩 처리하였다. 24시간 이후에 상층액으로 BIOTRAK ELISA human MMP-1 nRTN2601을 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2) 콜라겐 생합성
HDFn를 5×104 cells/well 농도로 24-well plate에 접종한 후 24시간 동안 37℃ incubator에서 배양하였다. 10% FBS+DMEM에서 약 50 ul를 취하여 동량의 trypan blue와 혼합하여 세포수를 측정하였다. 시료는 FBS가 제거된 배지로 100, 50 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 incubater에서 배양 후 콜라겐 생성 정도를 PIP assay kit(Takara)로 평가하였다. 양성대조군으로 L-AA(vitamin C) 도 동시에 콜라겐 합성 정도를 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP) EIA kit로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5. UVB 자극으로 인한 피부주름 유발
7주령의 HR-1에 UVB 램프로 등 피부에 조사하여 피부 변화에 대하여 효과를 검증하고자 동물실험 승인을 받고 연구를 진행하였다(승인번호 : DJUARB2022-029). 각 그룹당 5마리의 HR-1를 사용하였다. HR-1는 첫번째 1주일은 매일 같은 조건에서 100 mJ/cm2 UVB radiation을 조사하였고, 2주부터 9주까지는 200 mJ/cm2으로 UVB radiation을 주 3회(월, 수, 금) 조사하였다. HR-1 생쥐의 등피부에 정상군(Normal), 대조군 (UVB_vehicle control), S-W와 S-E를 200 ㎍/25 g/day 피부에 도포하고 5분간 흡수시킨 후 UVB를 15 cm에서 10분간 조사를 진행하였다<Table 1>.
6. 피부주름 측정
UVB로 유도된 피부노화는 주름의 깊이로 평가를 진행한다. 주름깊이는 6주와 9주에 chloral hydrate의 복강주사로 마취한 후, 피부주름은 UVB를 조사한 후 DETAX System II (MIXPAC)과 Double-Stick Disc(3M, Germany)와 Demo bella기기를 통해 측정하였다.
7. 피부의 조직학적 관찰
실험군에서 적출한 피부조직을 48시간 동안 10% formalin 용액에 고정한다. 조직은 조직처리기를 이용하여 1~2시간 정도 alcohol 70, 80, 90, 95, 100%를 이용하여 처리한 후 xylene으로 4시간, paraffin에서 4시간 처리한다. 고정된 조직은 Paraffin Embedding Station을 사용하여 embedding 한 후 24시간 냉동실에서 보관하고 Rotary Microtome를 이용하여 block을 박절하였다. 박절된 조직은 H&E staining을 실시한 슬라이드를 건조 후 kanadabalsam과 xylene를 이용하여 permounting후 현미경을 이용하여 표피/내피의 두께, lipid pore 등을 관찰하였다. 피부 dermis층에서 콜라겐 침착을 관찰하기 위하여 일부 슬라이드는 Masson’s trichrome염색을 실시하여 현미경으로 관찰하였다.
IV. 결과 및 고찰
1. 세포독성
S-W의 HDFn 세포독성을 측정한 결과 500, 250, 125, 62.5, 31.2 ㎍/㎖ 농도에서 생존율이 각각 82.4±5.4, 91.2±3.5, 97.5±4.6, 102.3±5.1, 104.2±2.4로 나타나, 100 ㎍/㎖ 이하 농도에서는 유의성 있는 감소는 나타나지 않았다. S-E의 세포독성을 측정한 결과 500, 250, 125, 62.5, 31.2 ㎍/㎖ 농도에서 생존율이 각각 81.5±4.8, 87.4±3.5, 95.3±6.1, 100.5±4.9, 102.5±3.1%로 나타나, 100 ㎍/㎖ 이하 농도에서는 유의성 있는 감소를 나타나지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 실험에 100 ㎍/㎖로 실험을 진행하였다(Fig. 1).
2. MMP-1 억제효과
MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)은 피부 진피층의 주요 성분인 콜라겐을 분해하는 효소로, 주름 형성과 피부 탄력 저하의 주요 원인으로 알려져 있다(Varani et al., 2006). 본 연구에서는 HDFn(Human Dermal Fibroblast Neonatal) 세포를 이용하여 SW와 SE가 MMP-1 발현 억제를 통해 주름 형성 억제에 미치는 영향을 평가한 결과, L-ascorbic acid는 항산화 작용을 통해 활성산소종(ROS)을 제거하고, ROS로 인해 유도되는 MMP-1 발현을 억제하여 피부 노화 및 주름 형성을 억제하는 효과가 있어(Jung et al., 2021; Kamei et al., 1996) 양성대조군으로 실험을 진행하였다. 양성 대조군인 L-ascorbic acid 처리군은 53.7±1.9, S-W는 50, 100 μg/㎖에서 40.5±5.4, 58.9±4.3%로 나타내었고, S-E는 50, 100 μg/㎖에서 43.2±4.5, 63.4±5.8%로 대조군에 비하여, 100 μg/㎖에서 유의적인 MMP-1 억제 효능을 나타내어 주름 형성 억제 효과를 확인하였다.
Kamei et al.(1996)의 연구에 따르면, L-ascorbic acid는 강력한 항산화제로 피부 노화 방지 및 주름 개선에 중요한 역할을 하며, Varani et al.(2006)은 MMP-1이 콜라겐 분해를 통해 피부 노화를 유도한다는 사실을 밝혔다. 또한, Wattanapitayakul & Bauer(2001)는 식물성 항산화제가 MMP-1 억제를 통해 피부 보호 효과를 나타낼 수 있음을 보고하였다. 본 연구 결과는 선행 연구와 일치하며, S-W와 S-E가 주름 억제 효능이 있음을 나타내었다(Fig. 2).
3. 콜라겐 생합성
콜라겐은 피부 진피층의 주요 구성 성분으로, 피부 탄력을 유지하고 주름 형성을 방지하는 데 핵심적인 역할을 한다(Varani et al., 2006). 나이가 들면서 자외선(UV) 등의 외부 자극에 의해 콜라겐 합성이 감소로 피부의 구조적 안정성이 약화되어 주름이 형성된다(Kwon et al., 2019).
본 연구에서는 L-ascorbic acid, SW와 SE를 처리하여 콜라겐 생합성에 미치는 영향을 평가하였다. L-ascorbic acid(비타민 C)는 콜라겐 합성을 촉진하는 주요 활성제로, 프로콜라겐의 수산화를 촉진하여 성숙한 콜라겐의 생합성을 돕는 것으로 알려져 있다(Murad et al., 1981).
연구결과, 양성 대조군 L-ascorbic acid 처리군은 53.7±1.9, S-W는 50, 100 μg/㎖에서 81.5±4.8, 95.4±5.7으로 나타내었고, S-E는 50, 100 μg/㎖에서 92.7±6.5, 112.6±2.8로 대조군에 비하여 SW에서는 100 μg/㎖에서 유의적인 효능을 나타내었으며 S-E에서는 50, 100 μg/㎖에서 유의적인 효능을 나타내었다.
이러한 결과는 콜라겐 합성 촉진은 주름 형성 억제와 밀접한 관련이 있다. 자외선 및 노화로 인해 활성산소종(ROS)이 증가하면 MMP-1의 발현이 유도되어 콜라겐 분해가 촉진되고, 이로 인해 피부 주름이 형성된다(Wattanapitayakul & Bauer, 2001). 반면, 콜라겐 생합성이 활성화되면 피부 진피층의 구조적 안정성이 강화되어 주름 형성을 억제할 수 있다. 본 연구에서 S-W와 S-E는 콜라겐 생합성을 유의미하게 촉진하였으며, 이는 주름 억제 효과와 관련이 있는 것으로 사료된다(Fig. 3).
4. 피부주름 깊이 측정
본 실험은 UVB에 의해서 유도된 피부노화의 정도는 주름으로 측정으로 평가한 결과(Fig. 4), Normal 군에서는 45.4±1.87, Control 군에서는 118.75±13.29 ㎛, S-W에서는 86.2±2.07 ㎛, S-E에서는 71.6±2.03 ㎛로 S-E에서 유의성 있는 감소효과를 나타내었다.
이는 UVB가 피부에서 활성산소종(ROS)의 과잉 생성을 유도하고 콜라겐 분해 효소인 MMP(matrix metalloproteinases)의 발현을 촉진함으로써 진피층의 구조적 변화를 초래했기 때문으로 판단된다(Fisher et al., 2002; Lee et al., 2020). 반면, S-W 군과 S-E군에서는 주름 형성이 억제되었으며 이를 DETAX System Ⅱ를 사용하여 피부 깊이를 정량적인 측정은 UVB 조사 후 피부 표면 변화를 객관적으로 평가하는 데 유용한 결과이다. 특히 S-E 군에서 유의미한 감소 효과가 관찰되었다. 이는 S-E 성분이 UVB로 인한 자극을 완화함과 동시에 피부를 보호함으로 주름의 깊이가 감소함을 나타내어 피부속 콜라겐과 진피층의 구조적 손상을 억제했음을 나타내었다(Seo et al., 2017; Kim et al., 2018).
5. 피부의 주름개선 관찰
본 연구는 UVB가 조사되어 피부 주름 유발된 마우스 피부의 주름개선을 관찰하기 위하여 ethyl ether로 마취한 후 생쥐의 등 피부를 USB Disital Microscope(×400, CE FOROHS, china)와 Demo bella로 피부조직을 400배 쵤영하여 주름의 변화를 관찰한 결과, 주름의 골이 얕아짐을 확인할 수 있었고, 피부의 주름의 개수가 감소함을 보였다. S-W와 S-E를 도포한 피부에서 주름의 감소를 나타내 항주름 효과를 얻은 것으로 보여지며, 이와 같은 결과는 MMP-1과 콜라겐 생합성의 결과와 일치함을 알 수 있다(Fig. 5).
6. 조직검사 결과
H&E 염색은 피부조직의 일반적인 구조와 세포핵 및 세포질 간의 대비를 확인하기 위하여 실험을 진행한 결과, Normal의 피부조직에 비해 control군은 epidermis의 두께가 국소적으로 두꺼워지거나 비정상적인 과각화(hyperkeratosis)가 나타난다(Kim et al., 2005). 이는 자외선에 의해 표피세포가 손상되고 과도한 각질세포가 축적된 결과이다. 섬유아 세포가 확장되면 조직의 과각화로 피부층의 두께증가, 과립조직 증가, 피부의 굴곡과 탈락의 증가, 면역세포의 침윤으로 염증 등이 증가로 이어진다.
S-W와 S-E군은 control에 비하여 epidermis의 두께가 정상군과 유사하게 감소하였으며, 조직의 과각화로 인한 피부층 두께 감소, 과립감소, 피부의 굴곡과 탈락의 감소, 면역세포의 억제로 염증의 감소로 이어져 광노화로 인한 피부조직 손상을 감소시켰다.
Masson’s trichrome 염색으로 콜라겐과 같은 진피 기질 성분의 변화 특히, 진피의 과도한 교차결합된 비정상적인 콜라겐이 축적되는 특징을 나타낸다(Fisher et al., 2002). Normal의 피부조직에 비해, UVB-Vehicle control군은 콜라겐 섬유(collagen fiber)가 많이 손상되어 있었으나, S-W와 S-E군은 control군에 비하여 콜라겐 섬유 손상이 적은 것을 관찰하였다. 이를 통해, S-W와 S-E 추출물 처리가 자외선에 의한 콜라겐 섬유 손상을 억제하는 효과가 있었다는 것을 알 수 있었다(Fig. 6).
V. 결 론
본 연구는 칠백고의 S-W(물 추출물)과 S-E(에탄올 추출물)이 UVB에 의해 형성된 HR-1의 피부주름에 미치는지 영향을 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 항노화에 대한 세포실험을 진행하기 위해 HDFn에 세포독성을 실험한 결과, S-W와 S-E는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 독성을 보이지 않아 실험에 적용할수 있는 농도로 정하였다. 이를 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) 억제효과와 콜라겐 생합성 실험을 적용한 결과, MMP-1 억제에서는 S-W와 S-E에서 100 ㎍/㎖에서 유의적 결과와 콜라겐 생합성에서 S-E에서 50, 100 ㎍/㎖ 유의적 결과는 Yun & Kim의 연구결과와 유사한 결과를 나타내어 항노화에 효과적인 소재임을 확인하였다.
2. 주름억제에 대한 HR-1에 대한 동물실험을 진행한 결과, DETAX System II(MIXPAC)과 Double-Stick Disc(3M, Germany)와 Demo bella의 기기로 주름깊이, 주름 개선관찰을 통해 실험한 결과, S-E에서 유의적인 결과를 얻었다. 또한, 피부조직을 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색 결과, UVB-Vehicle control에 비하여 epidermis의 두께가 정상군에 가깝게 감소하였으며, 과립세포의 감소, 피부의 굴곡과 탈락의 감소와, 면역세포의 억제로 염증의 감소로 광노화로 인한 피부조직 손상을 감소하였다. 콜라겐과 같은 진피 기질 성분의 변화을 알아보는 Masson’s trichrome 염색에서도 UVB-Vehicle control군에 비하여 콜라겐 섬유 손상이 적은 것을 관찰되어 S-E이 S-W에 비하여 효과적임을 확인하였다. 이는 갈화추출물에 대한 항주름 효과와 유사한 결과를 나타내어(Yun et al., 2018), 항노화에 효과적인 소재임을 확인하였다.
따라서 본 연구결과로부터 칠백고 추출물 중 S-E가 UVB 에 의해 형성된 HR-1의 피부주름 형성에 대해 억제 효과가 있음을 알 수 있었다. 향후에 이러한 면을 고려하여 S-E로부터 활성성분을 분리하여 다양한 연구를 진행할 가치가 있는 것으로 사료된다.
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