*Corresponding author: Seung-Jun Kwack Tel : +82-55-213-3550 E-mail : I. 서 론
최근 기능성화장품에 대한 관심이 높아지고 기능성 화장품 소재 개발에 대한 연구에 관심이 증대되고 있다. 특히 천연물질 원료에서 추출한 생리활성 물질들은 항산화, 항염증 효과뿐 아니라 미백, 주름 개선 등에 효능에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다. 그 중에서도 미백화장품의 성분의 기전을 살펴보면 melanocyte 내에서 melanin 생성을 억제하는 것과 melanocyte를 자극하는 물질을 조절하는 것, melanin의 배설을 촉진시키는 방법 등 3가지 정도를 꼽을 수 있다. Melanin 생성을 억제하는 방법은 melanin 생성에 관여하는 효소인 tyrosinase의 활성부위의 필수요소인 구리(Cu)를 제어하거나 tyrosinase 관련 단백질인 Tyrp-1(tyrosinase related protein I) 및 Tyrp-2(tyrosinase related protein II)의 필수요소인 철이온(Fe)을 제어하여 효소활성을 불활성화 시키는 방법이 주를 이루고 있다(Takamot et al., 1992). Tyrosinase 억제제는 미백과 관련되어 화장품 산업에서도 점점 중요하게 여겨지고 있고, 미백 합성 과정에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase 억제제는 피부 조직 내 melanin 색소의 생합성을 조절하기 위해 일반적으로 사용된다(Imokawa & Mishima, 1980; Imokawa & Mishima, 1981; Ohyama & Mishima, 1993). Melanin 생성을 억제하는 것으로 알려진 미백 원료로는 ascorbic acid, kojic acid, arbutin, rucinol 등이 대표적이다(Kim & Lee, 2007). Arbutin과 kojic acid는 강력한 미백효능이 있지만 피부 자극과 같은 안전성 문제 등의 일부 부작용이 알려져 있다(Cho et al., 2018). 또한 ascorbic acid의 경우 수용성 성분에서 분해되며 세포 투과성에 문제를 일으킬 수 있어 화장품 미백 원료로서 문제점이 대두되고 있다(Kim et al., 2015). 따라서 미백 화장품의 원료로 사용되는 성분은 피부 접촉에 의한 자극을 일으킬 수 있기 때문에 안전성이 높은 천연물질을 사용하여 미백 효능을 가지는 생리활성 물질을 찾으려는 시도가 꾸준히 증가하고 그에 대한 요구도가 높아지고 있다(Nohynek et al., 2004).
비단풀(Euphorbia humifusa)은 대극과(Euphorbiaceae)에 속하며 일년생 초본으로 밭 또는 길가에 흔하게 자라고 전 세계적으로 1,600종이 분포하며, 우리나라에는 11종의 비단 풀이 분포하고 있다(An et al., 2007; Choi & Lim, 2014). 땅바닥에 비단처럼 덮으며 자란다는 뜻으로 비단풀이라 하며 ‘점박이풀’, ‘땅빈대’, ‘내모초’, ‘지금초’, ‘선도초’, ‘지금(地錦)’, ‘지연(地聯)’, ‘장판초(醬瓣草)’, ‘초혈갈(草血竭)’, ‘혈풍초(血風草)’, ‘지판초(地瓣草)’ 등의 여러 이름을 가지고 있다(Park et al., 2015). 줄기는 뿌리 상단에서 둘로 나누어지고 많은 가지를 뻗으며 가운데에 붉은 반점이 있는 작은 타원형의 잎이 난다. 맛이 맵고 쓰며 성질이 평하고 해독, 청열이습, 양혈지혈, 습진, 화상, 모유부족, 자궁출혈, 혈액순환, 황달 등의 효능이 있어 주로 한방에서 약용으로 사용된다(Lee, 1989; Lee, 2003; Chinese Medicine Dictionary, 1999). 현재까지 보고된 비단풀의 선행연구에는 항암작용에 대한 연구에서는 대장암과 유방암의 유래 세포주에서 항암효과를 보이는 것으로 확인되었다(Ann et al., 2006). 다수의 논문에서 항균, 항염, 지혈, 항산화 효과가 연구되어졌다(Park et al., 2015). 비단풀 추출물의 항산화 및 생리활성에 대한 기존 연구들은 이미 다수 보고되어 있으며, 이들 연구는 대부분 연구 목적, 실험 모델, 평가 지표 측면에서 유사한 경향을 보인다. 비단풀은 다양한 선행연구를 통해 인체에 대한 긍정적인 효능이 검증되었으나, melanocyte 에 대한 생리활성 및 항산화 효과에 대한 연구는 미비하다. 따라서 본 연구에서는 비단풀 분획물의 melanocyte에 대한 생리활성과 항산화 효과를 알아보고자 한다(Fig. 1).
II. 재료 및 방법
1. 재료 및 분리정제
동의한재에서 구매한 건조 상태의 비단풀 300g에 80% 에탄올을 사용하여 30℃, 100 rpm으로 3일간 진탕 추출한 후 실린지 필터와 Büchner funnel를 사용하여 여과하였다. 회전식 감압농축기를 이용해 용매를 제거하고 추출된 용질을 정량한 후, 적정 농도로 조정하여 실험에 활용할 원액으로 제 조하였다. 용매분획은 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순으로 각각 3회씩 용매 분획을 수행하였다. 각 분획층은 감압 농축하여, hexane 분획물 0.8g, ethyl acetate 분획물 2.1g, butanol 분획물 3.9g, 물 분획물 13.5g을 얻어 실험 시료로 사용하였다.
2. 세포생존율 측정
시료가 세포의 성장률에 미치는 영향을 측정하기 위하여 Mouse melanoma B16-F10 세포를 96 well plate에 4×10⁴ cell/ml로 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다. MTT 시약(5 mg/mL)을 첨가 후 3시간 반응시켰으며, 원심분리(1000 rpm, 25°C, 3분)를 거쳐 상등액을 제거하였다. DMSO : Ethanol (1:1)을 혼합하여 ELISA micro plate reader(Bio-Rad, USA)로 570 nm 파장에서 흡광도를 3회 반복 측정하였다. 실험군의 평균 흡광도를 측정한 후, 대조군과의 비교를 통해 세포 증식에 대한 영향을 정량적으로 분석하였다. 본 연구는 인체 대상 연구가 아닌 세포 실험을 기반으로 하였으며, 「생명윤리 및 안전에 관한 법률」 제2조에 따라 연구윤리위원회(IRB)의 승인 대상에 해당하지 않음을 확인하였다(Fig. 2).
3. Melanin 함량 측정
Jang(2009)의 실험 프로토콜을 일부 수정하여 melanin 함량 측정을 적용하였다. B16-F10 세포를 6-well plate에 well 당 1.2 × 105 cells의 밀도로 24시간 동안 배양하였다. 이후 적정 농도의 알부틴 또는 비단풀 추출물을 포함한 배지로 교체하고 72시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 cell lysis buffer 로 세포를 용해시킨 후 10,000×g로 원심분리하여 상등액을 확보하였다. 이 상등액으로 BCA protein assay를 수행하여 melanin의 함량을 보정하였다. 건조시킨 펠렛에 1 M NaOH와 10% DMSO를 가하여 60°C에서 melanin을 용해하고, ELISA microplate reader로 405 nm 파장에서 흡광도를 3회 반복 측정하였다. 상대적 melanin 함량은 405 nm에서 측정하였고, 단백질 양으로 정량화하였다(Fig. 3).
4. 세포 내 tyrosinase 저해 활성 측정
B1-F10 세포를 6-well plate에 1×105 cells/well로 접종 후 24시간 동안 35°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 이후 α-MSH 50 nM과 함께 비단풀 에틸아세테이트 분획물(25, 50, 100 μg/mL)을 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 24시간 경과 후에는 배지를 교체하고 같은 조건으로 반복 처리하였다. 세포 수확 후 trypsin-EDTA로 분리하고, 0.2 mM PMSF와 1% Triton X-100이 포함된 67 mM phosphate buffer(pH 6.8) 500 μL를 처리한 뒤 초음파로 분해하였다. 4°C에서 12,000×g로 20분간 원심분리한 상등액을 tyrosinase 활성 분석에 사용하였다. DOPAchrome 생성을 측정하기 위해 L-tyrosine(9 μM), L-DOPA(4 mM), phosphate buffer를 혼합하여 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 3회 반복 측정하였다. 상대 활성은 α-MSH 단독 처리군 대비로 산출하였고, 단백질 양에 따라 보정하였다(Fig. 4). 미백 효능을 확인하기 위해 tyrosinase 저해 활성을 측정하여 미백 물질을 탐색한 결과, ethyl acetate 분획물이 hexane 분획물에 비해 수율이 높았으며, butanol 분획물보다 melanin 생성 억제 능력과 세포내 tyrosinase 효소활성 억제 능력이 우수하였음을 확인하였고, ethyl acetate 분획물로 이후 실험을 진행하였다.
5. DPPH radical 소거 활성 측정
Blois(1985)의 방법을 일부 수정하여 DPPH free radical 소거 활성을 평가하였다. DPPH는 화학적으로 매우 안정화된 free radical을 가지는 수용성 물질로서 515-520 nm에서 최대 흡광도를 가지는 진한 보라색을 나타내는 화합물이다. DPPH는 항산화 물질과 반응하면 전자가 이동되면서 free radical이 소거되어 진한 보라색에서 노란색으로 탈색되어 항산화 활성을 쉽게 확인할 수 있다. DPPH를 이용하여 각 추출물과 분획물의 DPPH free radical 소거 활성을 측정하였다. 시료액과 0.1 mM DPPH용액을 혼합하여 25~30분간 암실에서 반응시킨 후, ELISA microplate reader(Bio-Rad, USA)로 517 nm에서 흡광도를 3회 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 IC50 값을 비교하였다. 대조군으로는 arbutin과 L-ascorbic acid를 사용하였다.
6. ABTs radical 소거 활성 측정
Roberta(1999)의 방법을 기반으로 ABTS radical 소거 활성을 측정하였다. 7.4 mM(2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온, 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTs+을 형성시키고, 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.01가 되도록 ethanol로 희석하였다. 희석된 ABTs+에 시료를 가하여 10분 동안 방치한 후 ELISA microplate reader(Bio-Rad, USA)로 734 nm에서 흡광도를 3회 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 IC50 값을 비교하였다. 대조군으로는 arbutin과 L-ascorbic acid를 사용하였다.
III. 결과 및 고찰
1. Ethyl acetate 분획물의 melanin 생성 억제 및 tyrosinase 저해 활성 효과
B16F10 흑색종 세포주를 이용하여 비단풀의 ethyl acetate 분획물의 melanin 생성 억제 및 tyrosinase 효소 저해 활성을 평가하였다. 마우스 B16-F10 흑색종 세포에 비단풀 분획물(100 μg/mL)과 α-MSH(50 nM)를 동시 처리하고 48시간 배양 후 MTT 분석법으로 세포 생존율 측정 결과, 비단풀 분획물은 100 μg/mL의 농도에서 90~100%의 생존율을 나타내어 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다, B16-F10 흑색종 세포를 활용한 melanin contents 측정 실험을 진행하였다. α-MSH 같은 외부 인자가 melanoma cell이 자극받게 되면 melanin화가 활성화 되어 melanin이 합성된다(Jeon et al., 2013). α-MSH(50 nM)를 처리하여 melanin 생성을 유도한 B16F10 세포에 E-EtOAc를 농도별(25, 50, 100 μg/mL)로 처리한 후, 세포 내 melanin 함량을 측정하였다. 그 결과, ethyl acetate 분획물은 농도의존적으로 melanin 생성을 억제하였으며, 100 μg mL 농도에서 약 73%의 억제 효과를 보였다(Fig. 5). 이는 양성 대조군인 arbutin(100 μg/mL)과 유사하거나 우수한 수준의 미백 활성을 나타내는 것이다.
UV 자극에 의해 흑색종 및 melanocyte에 melanin 생성이 촉진된다. α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH), stem cell factor(SCF), endothelin-1(ET-1) 등은 melanin 생성을 촉진하기 위해 분비된다. Melanocyte 및 흑색종 세포의 분화 및 melanin 생성을 유도는 α-MSH가 담당한다. Melanocyte 및 흑색종 세포 수상돌기가 많아지고 수상돌기에 melanin 색소가 침착되어 대조군보다 α-MSH 처리군의 melanin 함량이 늘어난다. 또한, melanin 생성 저해 효과가 세포 생존율 저하에 의한 결과가 아님을 확인하기 위해 MTT 분석을 실시하였다. Ethyl acetate 분획물은 모든 농도(25~100 μg/mL)에서 85% 이상의 세포 생존율을 유지하였으며, 50 μg/mL 이상에서는 오히려 약간의 세포 생장 증가가 관찰되어 ethyl acetate 분획물이 독성이 없고 생리활성이 있음을 시사하였다(Fig. 6). 이후, 세포 내 tyrosinase 효소 활성을 측정한 결과, ethyl acetate 분획물은 농도의존적으로 tyrosinase 활성을 유의하게 억제하였다. 특히 100 μg/mL에서 가장 강한 저해 활성을 보여, α-MSH로 유도된 melanin 생성 억제가 tyrosinase 활성을 감소시킨데 기인함을 입증하였다(Fig. 7). 이러한 결과는 비단풀 ethyl acetate 분획물이 세포 독성 없이 melanin 합성과 관련된 주요 효소의 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 기능성 미백 소재로서의 가능성을 뒷받침한다(Hoon et al., 2014).
2. DPPH radical 소거 활성
DPPH는 자체적으로 안정된 free radical을 가지고 있는 화합물이다. 항산화 물질의 전자공여능으로 방향족 아민류 및 방향족 화합물에 의해 환원되어 보랏빛의 DPPH radical(DPPH)이 무색의 DPPH-H 형태로 전환되는 성질을 이용하여 항산화 활성을 측정하는 원리이다. DPPH radical 소거능의 IC50을 구하여 비교해 본 결과 비단풀 추출물, hexane fraction, ethyl acetate fraction, butanol fraction은 각각 0.0541% 0.1655%, 0.1448%로서 높은 radical 소거 활성을 확인할 수 있었다. 대조군으로 사용된 ascorbic acid와 비교하여 비단풀 추출물은 1.7배, ethyl acetate fraction은 24.1배, 효과가 우수하였고, arbutin과 비교하여 비단풀 추출물은 148배, ethyl acetate fraction은 2,028배로 ethyl acetate fraction > extract > ascorbic acid > butanol fraction> chloroform fraction> arbutin 순으로 효과가 우수하였다(Table 1).
3. ABTs radical 소거 활성
비단풀 추출물과 분획물의 ABTs radical 소거 활성 효과를 측정하기 위해 0.25%부터 0.0025%까지의 농도로 적용한 결과, 농도의존적인 소거 활성을 확인할 수 있었다. 대조군으로 사용된 ascorbic acid와 arbutin의 적용 결과에서도 농도의존적인 소거 활성을 확인할 수 있었다. ABTs radical 소거능의 IC50을 구하여 비교해 본 결과, Table 2와 같은 결과를 얻었다. 비단풀 추출물, chloroform fraction, ethyl acetate fraction, butanol fraction의 IC50은 각각 0.038%, 0.165%, 0.007%, 0.144%로 나타났다. 대조군으로 사용된 ascorbic acid와 비교하여 비단풀 추출물은 1.5배의 활성을 보였으며, ethyl acetate fraction 은 arbutin과 비교하여 15.1배의 melanin 억제 활성을 나타내어 현저한 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 ethyl acetate fraction이 미백 기능성 소재로서 높은 가능성을 나타냄을 시사한다(Table 2).
IV. 결 론
본 연구는 천연 약용 식물인 비단풀(Euphorbia humifusa)을 80% 에탄올로 추출하고, 이를 다양한 용매로 분획하여 melanin 생성 억제 및 항산화 활성에 대한 효능을 평가함으로써 기능성 미백 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다.
DPPH 및 ABTs 라디컬 소거 활성 분석 결과, ethyl acetate 분획물은 다른 분획물에 비해 우수한 항산화 활성을 나타내었다. DPPH는 ethyl acetate 분획물은 24.1배, ABTs를 활용한 활성에서는 비단풀 ethyl acetate 분획물에서 88.9배 효과를 내어 DPPH에서 보다 ABTs에서 항산화 활성이 더 우수하였다. 또한, B16F10 melanocyte에 α-MSH를 처리하여 유도한 melanin 생성 모델에서 ethyl acetate 분획물은 세포 생존율에 영향을 주지 않으면서, 농도의존적으로 melanin 생성 억제 효과를 나타냈다. 특히 100 μg/mL 농도에서 melanin 함량은 73%, tyrosinase 효소 활성이 45% 억제되어 미백 효능이 유의하게 확인되었다.
이러한 결과는 비단풀 ethyl acetate 분획물이 melanin 생합성 과정의 주요 효소인 tyrosinase의 활성을 억제하고, α-MSH 자극에 따른 melanin 생성을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 본 연구는 기존 비단풀 속 식물 연구들이 주로 보고한 정제되지 않은 추출물 수준의 효과를 넘어서, 각 용매 분획에 따른 생리활성과 색소 억제 효과를 체계적으로 비교하였다.
결론적으로, 비단풀 추출물, 특히 ethyl acetate 분획물은 항산화 활성과 melanin 생합성 억제 효능을 겸비한 천연 유래 미백 기능성 화장품 원료로 활용 가능성이 높다고 판단된다.
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