황색포도상구균과 표피포도상구균에 대한 아로마오일의 항균 효과
Antibacterial Effect of Aroma Oil on Stophylococcus aureus and S. epidermidis
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This study's primary objective was to confirm the antibacterial effect of aroma oil on Stophylococcus aureus and Stophylococcu epidermidis, the common bacteria of atopic dermatitis. Among the aroma oils, Thyme oil and Cinamon bark oil which have antibiotic effects against S. aureus, were selected through the disk diffusion method. In order to solve problems in use, such as delayed volatility and reduced toxicity of aroma oil, It was made into a gel using biodegradable polymers Curdlan (Curdlan: Cur) and carboxymethyl scleroglucan (CMSG). The experiment involved 4 groups of S. aureus and 4 groups of S. epidermis. As a result of the above experiment, S. aureus growth was completely inhibited in Group I and Group II at 150 μl and 200 μl of thyme oil. In Group III and Group IV, S. aureus growth was entirely restrained when the amount of Cinamon oil added was 200 μl. In Group V and Group VI, the growth of S. epidermidis was completely inhibited when 200 μl of Thyme oil was used. In Group VII and Group VIII, the growth of S. epidermidis was completely inhibited when 200 μl of Cinamon oil was used. The study's findings, in terms of cosmetology, Curdlan is possible to present the possibility of application as a new formulation that can enhance the improvement effect of atopic dermatitis.
I. 서 론
코로나 펜더믹 시대를 맞이하면서 과도한 스트레스 및 환경 공해로 인해 피부의 다양한 질환들이 발생되고 있다. 선행 연구 결과를 보면 이러한 피부 질환환자가 늘어나면서 피부 질환을 개선하기 위한 천연추출물에 대한 효능에 관심이 높아지며, Aroma oil들의 항균력과 관련된 기능성화장품과 약품에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 피부에 염증을 유발하는 상재균주로는 대표적으로 그람 양성균 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis 가 존재한다. 이들은 피부와 환경 중에 존재하는 병원성 세균들로 주로 염증, 고름, 발진 등의 감염증상을 나타내고 여드름, 중이염, 식중독 등의 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. S.aureus는 대표적 피부질환인 아토피 피부염 환자의 피부에서 90% 발견되며, S. epidermidis 도 면역력이 저하된 사람에게 패혈증, 심내막염 등을 일으키므로 주의 깊은 감염관리가 필요하다(Kim, 2017). 아토피 피부염의 치료제인 스테로이드제제를 장기적인 치료제로사용한 경우 인체에 해로운 영향력을 발휘할 수 있으며 생체 친화적이지 못한 문제점이 발생될 수 있다(Jo & Choi, 2002; Yang, 2007). 천연 소재에서 추출되는 Aroma oil은 대부분이 인체 내에서 알레르기 반응과 발암성이나 독성 등이 없는 생체 적합성 물질이다. 따라서 스테로이드의 대체 제제로서의 Aroma oil는 인체에 미치는 영향력이 우수하리라고 예측된다(Yang, 2007). 그러나 Aroma oil의 내·외 환경에 따른 항균력의 안정성을 증가시키기 위한 담체가 요구된다. 커들란(curdlan:Cur)은 세균류인 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)과 알칼리게네스(Alcaligenes sp.)의 미생물 발효에 의해서도 생산되는 비수용성의 β-1,3-Glucan으로 가열하면 응고되는 다당류이며, 화장품 보습제, 식품 첨가제로 많이 이용되는 안전하고 안정한 물질이다. 소수성 결합을 가지는 커들란 겔의 특성을 이용하여 지용성물질의 종류에 따라 건조시킨 겔 속에 상당한 양이 포함되는데, 건조중량의 90%까지 포함될 수 있었다고 보고되었다(Lee et al., 2002). 또한 독성이 낮고 안정성이 우수하기 때문에 식품학에서도 활용 가능성이 높아지고 있으며(Li et al., 2014), 최근 커들란의 면역 증강, 항암활성과 AIDS 바이러스 감염 저해 활성 등과 같은 새로운 특성들이 밝혀지면서 약물전달 시스템(DDS) 분야에서 주목받고 있다(Kim et al., 2000). 비스테로이드성 소염제 경구 투여로 인한 약물 부작용을 감소하기 위해 약물을 적제한 커들란을 미세구로 만들어 약물의 방출을 통재하였더니 pH 7. 4에서 약 1.5배 증가하여, 약물의 치료효과를 높일 수 있었고, 커들란은 산성조건에서 응집되고 알카리 조건에서 용해되는 특성이 있다고 보고된 바 있다(Lee et al., 2005). 이와 같은 결과는 커들란에 적재된 아로마의 방출력이 알카리성을 띠는 아토피 피부의 pH에 의해 영향을 받을 것으로 사료된다. 또한 다당류인 스클레로글루칸(Scleroglucan:Scl)은 식물의 담자균에서 분리되며 점착성과 열 안정성이 높아 화장품 제제나 약물의 리포좀 코팅제로 응용된다. 또한 생체 안정성이 높고 망상구조를 형성하는 특징이 있다. 커들란 겔에 포접된 아로마 방출의 유효성을 증가시키기 위하여 Carboxymethyl scleroglucan(CMSG)을 제조하였다(Yang, 2007). 따라서 커들란과 카복시메틸 스클레로글루칸은 지용성 아로마오일의 전달시스템의 담체(Carrier)로 가치가 높은 특성을 가지고 있다고 판단된다.
본 연구는 커들란과 CMSG 고분자 물질을 지용성 Aroma oil 담체로 선별 하여 Thyme, Cinamon oil을 포접시킨 커들란 겔과 CMSG-커들란겔을 제조하였다. 제조된 겔의 Aroma oil 방출에 의한 S. aureus와 S. epidermidis의 성장저해 영향력을 규명하고자 하였다.
II. 재료 및 방법
1. 균주 및 시료
Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917), Staphylococcus aureus(KCTC 1621)는 한국생명공학연구원의 균주은행에서 분양받았다. 미생물은 37°C에서 배양하였고 사용한 배지(nutrient broth, NB) 조성은 Table 1에 나타냈다. Thyme oil(Thymus vulgaris W306509), Cinamon bark oil(Cinnamonum zeylanicum Blume W229105)은 Sigma Chemical Co.(USA)에서 구입하여 사용하였다. Curdlan(Cur)은 Takeda Chemicl, Co.(Japan), Scleroglucan(Scl)은 Deggusa Co.(Trostberg, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
Components of Nutrient Broth
2. Carboxylmethyl scleroglucan (CMSG) 제조
스클레로글루칸 1. 5g과 isopropyl alcohol 40 ml를 실온에서 30분간 교반한 후 30% 수산화나트륨 용액 3 ml를 첨가하여 실온에서 70분간 교반시킨다. 이 용액에 1.8g monochloroacetic acid을 15분 간격으로 3번 첨가 후 50°C에서 60분간 반응시킨다. 원심분리 하여 침전물을 회수한 다음 증류수 40 ml에 용해시킨다. acetic acid로 중성 pH로 조절 후 methanol로 세척 후 동결건조 하였다.
3. Aroma oil의 S. aureus와 S. epidermidis에 대한 항균성
Thyme & Cinamon Aroma oil의 S. aureu & S. epidermidis에 대한 항균성은 Minimal Inhibitory Concentration(MIC) Test방법에 따라 디스크 확산 법(Disk diffusion)을 이용한 Aromatogram법으로 무균지대의 폭을 확인하였다.
* 성장저지대(clear zone:C.Z) 판독법
W = (T D)/2
W: 세균저지대의 폭(mm)
T: 시료와 저지대의 전체지름(mm)
D: 시료(Disk)의 지름(mm)
4. Curdlan Gel 제조
2.5% Curdlan(Cur)과 0. 5% K3PO4를 수용액에서 교반 제조한 후 homogenizer(T-25 Basic, IKA labortechnik, Germany)로 13,500 rpm으로 2분간 균질화 시킨 후 실온에서 방치하여 기포를 조절한 후 시험관에 부어 항온조(80°C, 30 Min: Labtech LCB-110)에서 열처리 후 상온에서 냉각하여 겔을 제조하였다.
5. CMSG-Curdlan Gel 제조
CMSG-Curdlan 겔은 1%(w/v)의 CMSG 수용액과 2.5%(w/v)의 curdlan 수용액을 1:l 비율로 혼합한 후 위와 동일한 방범으로 겔을 제조하였다.
6. Aroma oil이 포접된 Curdlan Gel 제조
2.5% Curdlan과 0.5% K3PO4를 수용액에서 교반 제조한 후 50 μl, 100 μl, 150 μl, 200 μl 농도별 아로마 오일을 첨가하여 homogenizer(T-25 Basic, IKA labortechnik, Germany) 13,500 rpm으로 2분간 균질화 시킨 후 실온에서 방치하여 기포를 조절한 후 시험관에 부어 항온조 (80°C, 30 Min: Labtech LCB-110)에서 열처리 후 상온에서 냉각하여 겔을 제조하였다(Fig. 1).
Production process of Aroma Oil-Loaded curdlan gels.
7. Aroma oil이 포접된 CMSG-Curdlan Gel 제조
CMSG-Curdlan(CMSG-Cur) 겔은 1%의 CMSG 수용액과 2.5%의 curdlan 수용액을 1:1 비율로 흔합한 후 50 μl, 100 μl, 150 μl, 200 μl 농도별 아로마 오일을 첨가하여 위와 동일한 방범으로 겔을 제조하였다.
8. 제조된 Gel의 S. aureus와 S. epidermidis에 대한 성장저해 측정 방법
1) Gel의 S. aureus와 S. epidermidis에 대한 성장저해 측정
제조된 Cur, Cur-CMSG Gel의 S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균성을 확인하기 위해 겔의 지름을 달리하여 아로마오일을 함유하지 않은 겔과 아로마오일을 함유한 겔의 항균력을 MIC방법을 응용하여 무균지대의 폭을 측정하였다.
2) Gel에서 방출된 Aroma oil의 S. aureus & S. epidermidis에 대한 성장저해 측정
멸균 시킨 배지 100 ml에 S. aureus, S. epidermidis를 100 μl씩 분주한 후, Aroma oil을 첨가하지 않은 대조군과 Aroma oil의 함양이 다르게 제조된 Cur, Cur-CMSG Gel을 첨가한 실험군을 incubator(37.5°C, 100rpm, Vision VS-8480SF)에서 배양하는 동안 5 ml시료를 정해진 시간별로 취하여 UV-spectrophotometer(Techne, Specgene FSPECGD, U.K)를 사용하여 600 nm에서 광학밀도(optical density)값인 흡광도(absorbance)를 측정하였고 Table 2에 나타냈다. 액체배지를 blank로 사용하였다.
Absorbance measurement value on growth of S.aureus & S. epidermidis in nutritional broth at 37 °C
III. 결과 및 고찰
1. CMSG 확인
점성이 높은 Scleroglucan의 용해력을 높이기위해 친수성화 시킨 후 합성한 CMSG를 FT-IR spectroscopy로 확인할 결과 1067 cm-1에서 C-0의 강한 스트레치(Stretch) 피크(peak)를 확인하였다. 1440cm-1 피크는 대칭 스트레치(symmetric stretch) 카르복실레이트(carboxylate)의 특성에 해당된다. 1689 cm-1의 피크는 비대칭 스트레치(asymmetric stretch) 카르복실산을 의미한다. 이와 같은 결과로 scleroglucan은 화학적으로 carboxymethyl기와 치환되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이러한 CMSG의 특성은 Curdlan gel의 제한된 Aroma oil 방출을 증가시키기 위한 첨가제로서 유용성이 높을 것으로 사료된다.
FT-IR Spectra of Scl and CMSG.
2. Thyme & Cinamon Aroma oil의 S. aureus와 S. epidermidis 성장저해 효과
균 성장저지대의 폭이 1.5 mm~2.0 mm를 weakly positive, 3.0 mm를 strong positive, 4.0 mm 이상은 respectable로 판단한 선행 논문(Kim, 2002)의 결과를 토대로, S. aureus 균주에서 Thyme oil은 14.5 mm, Cinamon oil은 11 mm, S. epidermidis 균주에서는 Thyme oil은 9.5 mm, Cinamon oil은 8. 5 mm의 성장 저지대가 발현되었으며, 항균 효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
Clear zone formed by antibaterial effect of aroma oils on S. aureus & S. epidermidis.
3. Curdlan Gel과 CMSG-Curdlan Gel 제조 및 성장저해 효과
지름의 길이가 다른(8 mm, 12 mm, 17 mm, 27 mm, 35 mm) 구형의 Curdlan Gel과 Gel의 수용성 방출속도를 증가시키기 위해 CMSG-Curdlan Gel을 제조하였다(Fig. 4).
Photograph of curdlan gels & CMSG-curdlan gels.
제조된 Curdlan Gel과 CMSG-Curdlan Gel의 S. aureus & S. epidermidis의 성장저해에 대한 항균력을 측정하였으나 성장저해능이 유의미하지 않음을 확인 하였다(Fig. 5).
Non-Antibacterial effect of curdlan (Cur) & CMSG-Cur gels on S. aureus & S. epidermidis.
4. 고체배지에서 Aroma oil이 포접된 Curdlan Gel과 CMSG-Curdlan Gel의 S. aureus & S. epidermidis 성장저해 효과
제조된 Curdlan Gel과 CMSG-Curdlan Gel의 항균력이 커들란 겔의 크기와 아로마의 농도 차이(8 mm-50 μl, 12 mm-100 μl, 17 mm-150 μl, 27 mm-200 μl, 35 mm-250 μl)에 의존적으로 향균 효과가 발현됨을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 그러나 Curdlan Gel과 CMSG-Curdlan Gel의 유의미적인 항균력은 나타나지 않았다. 따라서 제조된 carboxymethyl scleroglucan(CMSG)은 고체배지상태에서는 방출효과가 유의미하지 않다는 것을 확인할 수 있었다.
Clear zone formed by antibaterial effect of aroma oil-loaded Curdlan gels on S. aureus & S. epidermidis.
5. 액체배지에서 Gel로부터 방출된 Aroma oil의 균 성장저해 효과
본 실험의 결과 값 측정 편의상 8 Group(S. aureus 관련 4 Group, S. epidermidis 관련 4 Group)으로 다음과 같이 분류하였다. S. aureus 균주관련 Group I은 Thyme oil이 포접된 커들란겔(Cur Gel), Group II는 Thyme oil이 포접된 CMSG-커들란겔(CMSG-Cur Gel), Group III은 Cinamon oil이 포접된 커들란겔(Cur Gel)과 Group IV는 Cinamon oil이 포접된 CMSG-커들란겔(CMSG-Cur Gel)로 분류하였다. 또한 S. epidermidis 균주 관련 Group V는 Thyme oil이 포접된 커들란겔(Cur Gel), Group VI은 Thyme oil이 포접된 CMSG-커들란겔(CMSG-Cur Gel), Group VII은 Cinamon oil이 포접된 커들란겔(Cur Gel)과 Group VIII은 Cinamon oil이 포접된 CMSG-커들란겔(CMSG-Cur Gel)로 분류하였다.
1) Group I과 Group II의 S.aureus 성장저해 효과
Group I에서 Thyme oil의 첨가량이 150 μl(1.5g), 200 μl(2g)에서 균 성장이 완전 저지되었다. 또한 50 μl(0.5g)-8hr, 100 μl (1g)-16hr 기점으로 유의적 성장을 하였지만 모든 농도에서 대조군보다 균 성장억제 효과가 더 크게 나타났다. Group II에서는 Thyme oil의 첨가량 150 μl와 200 μl에서 Group I과 동일한 성장저해 효과가 나타났으며 50ul-8hr, 100ul-16hr 기점으로 균 성장 저해 효과가 Group I보다 더 크게 나타났다. 이는 CMSG의 영향력으로 판단되며, 결과적으로 Group I과 Group II의 모든 농도에서 대조군보다 균 성장억제 효과가 더 크게 나타났다. 대조군인 아로마겔을 처리하지 않은 S.aureus의 시간변화에 따른 균의 성장은 18hr까지 지속되었으며 18hr 기점으로 소폭의 감소율을 보였다(Fig. 7).
Inhibition effect of Group I and Group II on growth of S. aureus.
*Thyme oil-loaded Cur Gel (Group I), Thyme oil- oil-loaded CMSG-Cur Gel (Group II)
2) Group III과 Group IV의 S.aureus 성장저해 효과
Group III에서는 Cinamon oil의 첨가량이 200 μl에서는 균 성장이 완전 저지되었다. 또한 50 μl-14hr, 100 μl-20hr, 150 μl-22hr 기점 이후 대조군의 성장률 보다 더 큰 균 성장을 확인할 수 있었다. Group IV에서는 Cinamon oil의 첨가량이 200 μl 일 때 Group III과 큰 유의미적 차이가 없는 경향을 나타냈으며, 50 μl-8hr, 100 μl-18hr, 150 μl-24hr 이후에는 균 성장 저해 효과가 없음을 확인 할 수 있었다(Fig. 8).
Inhibition effect of Group III and Group IV on growth of S. aureus.
*Cinamon oil-loaded Cur Gel (Group III), Cinamon oil-loaded CMSG-Cur Gel (Group IV)
3) Group V와 Group VI의 S. epidermidis 성장저해 효과
Group V에서 Thyme oil 첨가량 200 μl일 때 균 성장이 완전 저지되었다. 50 μl-14hr, 100 μl-22hr, 150 μl-22hr 기점부터는 균 성장저해 효과가 없었으며, 50 μl-14hr 기점 이후 대조군의 성장률 보다 더 큰 균 성장을 확인할 수 있었다. Group VI에서는 200 μl에서는 균 성장이 완전 저지되었다. 50 μl-8hr, 100 μl22hr, 150 μl-24hr 기점으로 균 성장저해 효과가 없었으며, 오히려 50 μl-8hr기점 이후 대조군의 성장률 보다 더 큰 균 성장을 확인 할 수 있었다(Fig. 9).
Inhibition effect of Group V and Group VI on growth of S. epidermidis.
*Thyme oil-loaded Cur Gel (Group V), Thyme oil-loaded CMSG-Cur Gel (Group VI)
4) Group VII와 Group VIII의 S. epidermidis 성장저해 효과
Group VII에서 Cinamon oil 첨가량 200 μl, 150 μl에서 S. epidermidis 성장이 완전 저지되었다. 50 μl-10hr, 100 μl-10hr 기점이후 대조군의 성장률 보다 더 큰 균 성장을 확인할 수 있었다. Group VIII의 200 μl, 150 μl에서는 균 성장이 완전히 저지되었다. 50 μl-8hr, 100 μl-22hr 기점 이후 대조군의 성장률 보다 더 큰 균 성장을 확인할 수 있었다(Fig. 10).
Inhibition effect of Group vii and Group viii on growth of S. epidermidis.
*Cinamon oil-loaded Cur Gel (Group vii), Cinamon oil-loaded CMSG-Cur Gel (Group viii)
Aroma oil이 포접된 커들란겔을 제조하였으며, S. aureuse와 S. epidermidis에 대한 성장 저해 실험에서 배양액에 첨가한 양이 증가할수록 성장 저해 효과가 높게 나타났다. 따라서 Thyme, Cinamon Aroma oil이 포접된 커들란 겔은 S. aureuse와 S. epidermidis에 대한 성장저해 능이 높아 아토피 피부염증상 완화제로서 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
IV. 결 론
본 연구에서는 Aroma oil의 휘발성 지연과 독성감소 등의 사용상 문제점을 해결하기 위해 생체적합성, 생분해성 고분자물질 커들란(Curdlan:Cur)과 방출효율을 높이기 위해 carboxymethyl scleroglucan(CMSG)을 합성하였고, Thyme, Cinamon oil의 담체로 사용하여 그 기전에 대하여 확인하였다. Thyme, Cinamon oil을 포접한 커들란 Gel과 CMSG-커들란 Gel을 제조한 후 aroma oil 방출에 의한 S. aureus, S. epidermidis의 생육 억제 정도를 확인한 결과 8 Group 모두 aroma oil 농도 의존적으로 유의하게 감소하였으며, aroma oil 200 μl 농도에서 가장 큰 균 성장 저해 효과를 확인 할 수 있었다. 그러나 커들란-CMSG Gel Group의 aroma oil 방출 통제력은 안정성과 효능의 유의성이 높지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 Thyme, Cinamon oil이 포접된 Curdlan Gel은 아토피 피부염 개선효과를 증진 시킬 수 있는 새로운 제제로서 응용가능성을 제시할 수 있다. 또한, 아로마오일 종류와 특성에 따라 가장 적합한 담체로서 고분자 물질의 유효성 연구는 추가 진행되어야 한다고 사료된다.
